非小細胞肺癌組織中HHLA2表達變化及其意義

劉春，鄧述愷

(1達州市中心醫院，四川達州 635000；2西南醫科大學附屬第一醫院)

非小細胞肺癌組織中HHLA2表達變化及其意義

劉春1，鄧述愷2

(1達州市中心醫院，四川達州 635000；2西南醫科大學附屬第一醫院)

目的 觀察非小細胞肺癌(NSCLC)組織中人內源性逆轉錄病毒-H-長末端重復關聯蛋白2(HHLA2)的表達變化，并探討其意義。方法 NSCLC組織60例份(腫瘤組)，癌旁組織(至少距腫瘤邊緣5 cm以上)30例份(癌旁組)，采用免疫組化En Vision法檢測兩組HHLA2，分析HHLA2表達與NSCLC臨床病理參數的關系。結果 腫瘤組及癌旁組HHLA2陽性率分別為81.67%、13.33%，兩組比較，P<0.05。HHLA2表達與NSCLC患者性別、年齡、吸煙情況、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移均無相關性(P均>0.05)。結論 NSCLC組織中HHLA2表達升高，其表達與NSCLC臨床病理參數均無相關性；HHLA2可能成為NSCLC免疫檢查及治療的新靶點。

人內源性逆轉錄病毒-H-長末端重復關聯蛋白2；非小細胞肺癌；免疫組織化學

肺癌按組織病理學分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，NSCLC占肺癌的比例約85%。免疫逃逸和腫瘤微環境是腫瘤發生發展的重要原因之一，在手術、放療、化療等傳統綜合治療基礎上，免疫治療已取得重要進展，CTLA-4、PD-1通路在肺癌等惡性腫瘤中已表現出良好的療效[1]，Nivolumab已被FDA批準用于鱗狀NSCLC的治療[2]。人內源性逆轉錄病毒-H-長末端重復關聯蛋白2(HHLA2)為B7家族新成員[3]，同時也被稱為B7-H7、B7-H5、B7y，為T細胞共抑制分子，在NSCLC等多種實體惡性腫瘤組織中呈高表達。研究[4]發現，HHLA2與NSCLC的EGFR基因突變及肺腺癌的淋巴結轉移存在相關性。HHLA2的免疫調控機制在NSCLC的發生發展過程中發揮重要作用，有可能成為免疫檢查及治療新靶點。本研究采用免疫組化法檢測NSCLC組織中HHLA2表達，分析其與NSCLC臨床病理參數的關系，旨在為NSCLC的免疫檢查及治療尋找新的免疫靶點提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選取西南醫科大學附屬第一醫院病理科2015年1～12月保存的NSCLC標本60例份(腫瘤組)，所有標本均經病理證實。患者男42例，女18例；年齡≥60歲25例，<60歲35例；有吸煙史29例，無吸煙史31例；病理類型為鱗癌30例，腺癌30例；臨床分期Ⅰ期+Ⅱ期39例，Ⅲ期+Ⅳ期21例；無淋巴結轉移35例，有淋巴結轉移25例。無其他肺部疾病及其他組織、器官的惡性腫瘤，術前未行化療、放療、免疫治療及其他針對惡性腫瘤的治療。另選30例份癌旁組織(至少距腫瘤邊緣5 cm以上)作對照(癌旁組)。

1.2 組織HHLA2檢測方法 使用型號為RM2235的德國LEICA轉輪式切片機分別切取厚度為4 μm的NSCLC、癌旁肺組織蠟塊各3張，其中2張用于本次實驗行免疫組化染色，剩下1張用于HE染色以核實診斷。免疫組化采用En Vision法，常規烤片、脫蠟，脫苯、內源性過氧化物酶滅活、修復抗原、加一抗、加二抗、顯色、復染、分化、梯度酒精脫水、透明、封片、鏡檢。以PBS代替一抗為陰性對照。染色結果判斷：HHLA2主要定位于細胞膜和細胞質，出現棕黃色或黃色顆粒定義為陽性細胞。參照文獻[5]方法，免疫組化結果采用半定量法進行分析，染色強度×陽性細胞百分比=免疫反應評分。隨機在高倍顯微鏡(×400)下取10個視野，取其均值，計算染色陽性的腫瘤細胞占視野內所有腫瘤細胞的百分比，0=0～10%染色，1=11%～25%，2=26%～50%，3=51%～75%，4=76%～100%；根據細胞膜和細胞質的染色強度進行評分：未見顯色的評為0分，顯色強度為淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；將兩項指標的得分相乘，按照得分結果進行判定：0分為陰性(-)，1分為弱陽性(+)，2分為中等陽性(++)，≥3分為強陽性(+++)。評分時避開腫瘤壞死區域和腫瘤邊緣部分，評分只包括腫瘤細胞，腫瘤間質細胞不作計數。在本次研究中，將得分為1分及以上的按陽性表達計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。采用χ2檢驗對HHLA2的陽性表達率、HHLA2與NSCLC臨床病理參數的關系進行分析比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組HHLA2表達比較 腫瘤組及癌旁組HHLA2陽性率分別為81.67%、13.33%，兩組比較，P<0.05。

2.2 HHLA2表達與NSCLC臨床病理參數的關系 結果見表1。由表1可知，HHLA2表達與NSCLC患者性別、年齡、吸煙情況、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移均無相關性(P均>0.05)。

表1 HHLA2表達與 NSCLC臨床病理參數的關系

3 討論

原發性支氣管肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內發病率和病死率均呈上升趨勢。據世界衛生組織國際癌癥研究署(IARC)2010年報告顯示，2008年全球肺癌新發病例約161萬例，占惡性腫瘤新發病例數的13%，居惡性腫瘤首位，而死亡約138萬例，占惡性腫瘤死亡病例數的18%。按組織病理學，肺癌分為SCLC和NSCLC，而NSCLC是肺癌中最常見的組織學類型，占比約為85%。

HHLA2為近年發現的B7家族新成員[4]，同時也被稱為B7-H7、B7-H5、B7y，為T細胞共抑制分子，位于人類基因染色體3q13.13區，是一個由含有414個氨基酸的開放閱讀框及3個胞外免疫球蛋白超家族結構域所組成的Ⅰ型跨膜蛋白，與B7家族的其他成員有顯著同源性[5,6]。HHLA2作為T細胞的負性共刺激分子，廣泛表達于人抗原呈遞細胞和T細胞。

肺癌屬免疫原性腫瘤，共抑制分子在NSCLC組織的表達代表腫瘤免疫逃逸機制之一[6]。有效的抗腫瘤免疫治療需要成功激活T淋巴細胞，而T細胞激活則需要雙重信號的協同作用，一是主要組織相容性復合體，另一個是協同刺激信號。而B7家族共信號分子為協同刺激信號的主要來源，其主要成員包括PD-L1(B7-H1)、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、HHLA2(B7-H7)[7,8]。HHLA2作為T細胞的負性共刺激分子，其導致腫瘤的發生可能存在以下幾種機制：①在T細胞受體信號傳導作用下，抑制CD4+、CD8+T細胞的增殖功能，導致腫瘤細胞逃避細胞毒性T細胞的殺傷活性，減弱機體的抗腫瘤免疫應答，從而促使腫瘤免疫逃逸[9,10]；②在多種炎癥因子刺激作用下，激活樹突狀細胞和巨噬細胞中靜息狀態的HHLA2，誘導腫瘤抗原特異性T細胞凋亡，降低腫瘤微環境中T細胞免疫效應，介導腫瘤的免疫逃逸[11]；③HHLA2可以通過與其受體TMIGD2結合后激活磷酸肌醇3-激酶和絲氨酸-蘇氨酸激酶AKT依賴性信號級聯途徑，抑制細胞周期相關蛋白表達和基因轉錄，阻礙細胞周期進展，抑制T細胞增殖，從而導致腫瘤的發生[12]；④當HHLA2和TMIGD2結合后在血管生成期間起到減少細胞遷移和促進毛細血管形成的作用，HHLA2-TMIGD2途徑可能對提高腫瘤血管內皮生成發揮重要作用[13]。

TMIGD2為HHLA2的特異性受體，主要存在于內皮細胞和上皮細胞，參與體內多種免疫反應，在T細胞、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞均可發現，但TMIGD2主要表達于幼稚T細胞和自然殺傷細胞，在抗原呈遞細胞中不表達。據研究[4,14]，HHLA2除在胎盤、腎臟、腸、膽囊、乳腺外的大多數人類正常組織中不表達外，其在包括肺癌、黑色素瘤、食管癌等多種惡性腫瘤組織中均呈高表達，這種在惡性腫瘤中廣泛表達表明HHLA2可能在腫瘤進展的關鍵步驟發揮作用。而Cheng等[6]發現，HHLA2在NSCLC的高表達和EGFR基因突變存在相關性，因此阻斷HHLA2-TMIGD2途徑使NSCLC進行免疫治療成為可能。但是，HHLA2與其受體TMIGD2結合的相關機制及信號通路目前尚未明確，需進一步研究。

本研究顯示，腫瘤組NSCLC陽性率高于癌旁組，提示HHLA2可能在NSCLC的發生發展過程中發揮著重要作用，可能成為NSCLC免疫檢查及治療的新靶點。本研究還發現，HHLA2表達與NSCLC患者性別、年齡、吸煙情況、病理類型、臨床分期、淋巴結轉移均無相關性，提示該結果可能由于樣本量少，需繼續深入研究HHLA2在腫瘤中的表達及作用機制，探討HHLA2及特異性受體TMIGD2參與的信號通路在NSCLC的發生發展過程中的作用，為HHLA2可能成為免疫檢查及治療的新靶點提供依據。

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鄧述愷(E-mail:dsk-lan@163.com)

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1002-266X(2017)31-0064-03

2017-06-11)