糖尿病腎臟疾病患者血清miR-16-5p水平變化及其意義

張琳，唐平易，周俊，劉立亞，唐東興

(1南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽 421001；2衡陽市中醫醫院(南院)；3湖南醫藥學院)

糖尿病腎臟疾病患者血清miR-16-5p水平變化及其意義

張琳1，唐平易2，周俊1，劉立亞3，唐東興1

(1南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽 421001；2衡陽市中醫醫院(南院)；3湖南醫藥學院)

目的 觀察糖尿病腎臟疾病(DKD)患者血清微小RNA-16-5p(miR-16-5p)的水平變化，并探討其意義。方法 DKD患者53例(觀察組)，其中尿蛋白正常者16例、DKD Ⅲ期者19例、Ⅳ期者12例、Ⅴ期者6例，另選50例健康體檢者作為對照組。采用實時熒光定量PCR技術檢測血清miR-16-5p，ROC曲線分析血清miR-16-5p水平對DKD的診斷價值，Pearson相關分析法分析其與空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、24 h尿白蛋白量的相關性。結果 觀察組及對照組血清miR-16-5p水平分別為0.45±0.25、1.00±0.30，兩組比較，P<0.01。觀察組尿蛋白正常者及DKD Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期者血清miR-16-5p水平分別為0.65±0.29、0.32±0.22、0.30±0.16、0.48±0.12，尿蛋白正常者、DKDⅤ期者與DKDⅢ期者、Ⅳ期者比較，P均<0.05。血清miR-16-5p水平預測DKD的ROC曲線下面積為0.931(95%CI：0.883～0.980)，以miR-16-5p水平0.665為截斷點，其診斷DKD的靈敏度為86.0%、特異度為88.7%。觀察組血清miR-16-5p與FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量均呈負相關(r分別為-0.71、-0.43、-0.53、-0.72，P均<0.01)。結論 DKD患者血清miR-16-5p水平降低，且隨病情嚴重程度變化而變化，檢測此指標有助于DKD的診斷及病情嚴重程度判斷。

糖尿病；糖尿病腎臟疾病；微小RNA-16-5p

糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病患者最常見且最嚴重的慢性并發癥之一，如未能有效控制，疾病發展到中后期腎功能將呈進行性下降。目前，DKD已成為發達國家終末期腎臟病(ESRD)的首要原因。DKD在我國的比率也日益升高，約占ESRD病因的16.4%[1]。微小RNA(miRNA)是長約21～25個核苷酸的高度保守的內源性非編碼單鏈RNA分子，主要參與基因轉錄后水平的調控。miRNA通過與靶mRNA結合，誘導mRNA降解，從而導致翻譯抑制，影響靶mRNA的表達。目前發現miRNA有一個龐大的小分子調控RNA家族，它們參與機體生長、發育、衰老及疾病的發生發展過程[2,3]。越來越多的研究發現，miRNA是慢性腎臟疾病病情進展的重要生物學標記[4,5]，其異常表達參與DKD的發病[6]。miR-16-5p與糖尿病高血糖、高胰島素及胰島素抵抗密切相關[7,8]，然而其在DKD患者血清中的表達情況及其與腎臟病情的相關性目前鮮有報道。本研究觀察了DKD患者血清miR-16-5p的水平變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6～9月南華大學附屬第二醫院收治的DKD患者53例(觀察組)，男31例，女22例；年齡46～76(54.2±7.2)歲；尿蛋白正常者(病程超過10年無DKD及DKD Ⅰ～Ⅱ期)16例、DKD Ⅲ期者19例、DKD Ⅳ期者12例、DKD Ⅴ期者6例；BMI(25.2±3.4)kg/m2；血壓(124±22)/(80±12)mmHg。DKD的診斷標準和臨床分期標準參考DKD Mogensen分期標準和中華醫學會制定的《中國2型糖尿病防治指南(2013版)》。排除標準：并發其他急慢性腎病，嚴重血液、心、肺、肝、神經系統疾病者，急慢性感染、器官移植、腫瘤、自身免疫性疾病者。另選取同期健康體檢者50例作為對照組，男30例，女20例；年齡43～72(55.7±6.7)歲；BMI(24.8±3.5)kg/m2；血壓(119±20)/(78±11)mmHg。本研究征得所有研究受試者本人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察方法 ①miR-16-5p：受試者均于早晨空腹采用普通生化管抽取肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，取1 mL血清用于miR-16-5p檢測。使用TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA。運用實時熒光定量PCR法檢測miR-16-5p。按照miR-16-5p序列5′-UAGCAGCACGUAAAUAU-UGGCG-3′設計逆轉錄莖環引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA-

CCGCCAA-3′。PCR上游引物：5′-CTCGCTAGCAG-CACGTAAATA-3′，下游引物：5′-TCCAGTGCAGGGT-CCGAGGT-3′。以Cel-39為內參，內參引物及PCR條件參考文獻[9]報道。Rever Tra Ace?逆轉錄試劑盒(日本Toyobo公司)逆轉錄RNA，PCR使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(大連Takara公司)在實時定量PCR儀(美國ABI公司)上進行，操作嚴格按照產品說明書進行。采用2-ΔΔCT法計算miR-16-5p相對表達量。②空腹血糖(FPG)：于早晨空腹采用普通生化管抽取肘靜脈血2 mL，以3 000 r/min離心10 min分離血清，采用己糖激酶法測定FPG。③糖化血紅蛋白(HbA1c)：于早晨空腹采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝試管抽取肘靜脈血2 mL，運用測定儀檢測HbA1c。④尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、24 h尿白蛋白量：所有受試者均在排除發熱、劇烈運動、顯著高血壓狀態等可能引起尿蛋白排泄增加的情況下，收集24 h內所有尿液標本，即將早晨6點至次日早晨6點的混合尿定義為24 h尿，將該天中任意一段時間點留取的尿液定義為隨機尿。留取隨機尿、24 h尿，吸取混勻尿液2～3 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液。使用日立7600全自動生化分析儀，采用免疫比濁法測定尿白蛋白，采用堿性苦味酸法測定尿肌酐，計算UACR，UACR=尿白蛋白(mg)/尿肌酐(g)；以上指標所用試劑、標準品和質控品均由北京利德曼生化技術有限公司提供。

2 結果

2.1 兩組血清miR-16-5p水平比較 觀察組及對照組血清miR-16-5p水平分別為0.45±0.25、1.00±0.30，兩組比較，P<0.01。觀察組尿蛋白正常及DKD Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期者血清miR-16-5p水平分別為0.65±0.29、0.32±0.22、0.30±0.16、0.48±0.12，尿蛋白正常者、DKDⅤ期者與DKDⅢ期者、Ⅳ期者比較，P均<0.05。

2.2 血清miR-16-5p水平預測DKD的ROC曲線分析 血清miR-16-5p水平預測DKD的ROC曲線下面積為0.931(95%CI：0.883～0.980)，以miR-16-5p水平0.665為截斷點，其診斷DKD的靈敏度為86.0%、特異度為88.7%。

2.3 觀察組血清miR-16-5p與FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量的相關性分析 兩組FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量比較見表1。觀察組血清miR-16-5p與FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量均呈負相關(r分別為-0.71、-0.43、-0.53、-0.72，P均<0.01)。

表1 兩組FPG、HbA1c、UACR、24 h尿白蛋白量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

3 討論

DKD是由糖尿病引起的慢性腎病，具有發病率高、預后不良的特點，高血糖是導致慢性腎病發生與發展的重要原因[10]。然而，高血糖導致慢性腎病發生與進展的分子機制目前尚不完全清楚。有研究[4,5]表明，miRNA靶向調控靶基因轉錄后水平表達是表觀遺傳學調控的重要方式，異常表達的miRNA參與DKD發生發展。明確與DKD發病相關的特異度miRNA及可能機制，將有利于DKD的早期診斷和靶向干預治療。近年研究[6]發現，多種miRNA如miR-375、miR-9、miR-204/211等都參與了DKD的發病，并伴有血清中表達量變化，將可能作為DKD的生物標志物。

文獻[7,8]報道，血糖增高導致患者miR-16-5p表達明顯下調。然而，miR-16-5p低表達是否與DKD患者腎臟病情相關，目前尚未見相關報道。本研究發現，觀察組患者血清miR-16-5p水平低于健康對照。進一步分析觀察組中不同亞組患者miR-16-5p的表達情況發現，DKDⅢ期、Ⅳ期者miR-16-5p水平低于尿蛋白正常及DKD Ⅴ期者。這表明miR-16-5p可能不僅參與DKD早期的發生，在中晚期病程進展中還可能起著非常重要的作用。另本研究還發現，以血清miR-16-5p水平0.665為截斷點，其診斷DKD的靈敏度為86.0%、特異度為88.7%。因此，初步推測血清miR-16-5p可以作為診斷DKD患者的生物學指標。

以血糖升高為始因并糖代謝紊亂參與始終的DKD患者存在明顯miR-16-5p低表達。本研究證實，血清miR-16-5p水平與FPG、HbA1c水平均呈負相關，這與先前的研究[7,8]結果一致。根據DKD Mogensen分期標準，微量蛋白尿的出現被認為是臨床早期診斷DKD的主要線索，它不僅反映了腎臟的損害，還是全身血管內皮損害的顯著標志。DKD一旦出現明顯的蛋白尿，進入Ⅲ期、Ⅳ期，其進程常難以逆轉。病程進展關鍵時期，如得不到有效治療，50%患者7年內可發展為終末期腎病[11]。UACR和24 h尿白蛋白量檢測是臨床常用的協助DKD分期診斷的重要指標。本研究發現，miR-16-5p水平與UACR、24 h尿白蛋白量呈負相關，提示miR-16-5p的表達下調與DKD腎損害密切相關，可能參與腎損傷的發生發展。

DKD發病機制復雜[12]，其特異性病理改變是結節性腎小球硬化，本質是常見而難治的微血管并發癥合并灶狀腎小管萎縮和腎間質纖維化。而血管內皮功能障礙是微血管病變的主要發病機理之一。血管內皮細胞的功能維持是重建血管完整性和維持組織灌注的基礎。通過文獻分析發現，miR-16-5p可能在多方面參與糖尿病腎損傷。體外和小鼠動物實驗研究表明，miR-16-5p作為血管調控因子，其低表達通過上調VEGF-A、VEGFR2、FGF-R1基因表達，參與調控血管內皮細胞的增殖、遷移，導致微循環功能障礙和影響血管生成等[13]。負向調控過高表達的VEGF-A可使小鼠DKD模型腎功能得到改善[14]。但miR-16-5p具體如何參與DKD病情進展的研究目前尚未見相應報道。還有研究[12]認為DKD的發生發展與腎臟慢性炎癥有關。慢性炎癥將最終導致腎纖維化、腎功能衰竭。miR-16-5p可能是一種與炎癥負向相關的調控因子，其表達下調與炎癥有關。在大鼠糖尿病模型中，miR-16-5p的水平與腎臟病理指標呈負相關，正向調控miR-16-5p的表達對糖尿病誘導的腎纖維化有保護作用[15]。國內外研究[16]報道，miR-16-5p在LPS誘導的急性肺損傷的模型中表達下調，通過上調miR-16-5p能抑制炎癥反應、減輕肺損傷。同樣，在系統性紅斑狼瘡患者體內miR-16-5p也存在表達下調，并且其與狼瘡病情活動有關[17]。對妊娠糖尿病患者的研究中發現，臍靜脈內皮細胞下調的miR-16-5p能通過調控COX-2基因轉錄后表達，介導炎癥失調導致內皮功能障礙[18]。這提示miR-16-5p可能是DKD重要的調控靶點。

總之，DKD患者血清miR-16-5p水平明顯下調，可作為診斷DKD的指標，具有較高的靈敏度和特異度。且下調的miR-16-5p與DKD患者血糖控制和尿白蛋白水平密切相關，可能參與調控糖尿病腎臟病理損傷。然而，miR-16-5p通過何種機制參與調控有待于進一步研究。

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湖南省自然科學基金面上項目(2017JJ2199)。

周俊(E-mail： 420069344@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.016

R587.2

B

1002-266X(2017)31-0055-04

2017-03-13)