轉化生長因子-β對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇表達的影響及其機制

李瑞，寧楊，田訓，李莉，王玉蘭，曾珍，龔丹妮，黃磊，李賀梅，張慶華

(華中科技大學附屬武漢中心醫院，武漢 430014)

·基礎研究·

轉化生長因子-β對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇表達的影響及其機制

李瑞，寧楊，田訓，李莉，王玉蘭，曾珍，龔丹妮，黃磊，李賀梅，張慶華

(華中科技大學附屬武漢中心醫院，武漢 430014)

目的 觀察轉化生長因子-β(TGF-β)對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表達的影響，并探討其可能機制。方法 取對數生長期SK-OV-3細胞，隨機分為兩組，觀察組用2 mL培養液+2 μL無血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培養(最終濃度為5 ng/mL)，對照組直接加2 mL培養液。流式細胞儀檢測細胞內總的活性氧簇(ROS)產生及線粒體來源的ROS,實時熒光定量PCR檢測細胞上皮細胞-間充質轉化(EMT)變化各指標、線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ組分mRNA。結果 觀察組及對照組總ROS產生量分別為3 159±42.92、1 062±24.41，兩組比較，P<0.05。觀察組及對照組細胞內線粒體來源ROS產生量分別為1 254±29.04、1 039±17.32，兩組比較，P<0.05。觀察組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、ZEB1分別是對照組的0.200 0、6.739 8、4.487 9、1.639 5倍，P均<0.05。觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表達水平較對照組改變倍數分別為0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平較對照組改變倍數分別為1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍，P均>0.05。結論 TGF-β誘導細胞內總的ROS表達增加，但過量ROS并非來源于線粒體，機制可能是通過調控細胞內氧化-抗氧化平衡系統的關鍵酶從而改變細胞內的ROS水平。

轉化生長因子-β；人卵巢癌細胞系；SK-OV-3細胞；活性氧簇；上皮細胞-間充質轉化；線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ

轉化生長因子-β(TGF-β)是腫瘤發生及轉移的關鍵調控者，其在卵巢癌復發灶的表達水平比卵巢癌原發灶高[1,2]，并且通過誘導卵巢癌細胞發生上皮細胞-間充質轉化(EMT)從而增強卵巢癌細胞的侵襲與轉移能力[3,4]。TGF-β信號通路改變引起的EMT等變化是腫瘤增殖、侵襲及轉移的重要原因[5,6]。近期有關乳腺癌及腎癌的研究顯示，TGF-β誘導細胞內ROS產生增多，并與癌細胞發生EMT密切相關[7,8]。但是，TGF-β誘導細胞內ROS產生的機制尚不明確。本研究觀察了TGF-β對人卵巢癌細胞系SK-OV-3活性氧簇(ROS)表達的影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞系SK-OV-3購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。MyCoy′5A培養基、胰酶、胎牛血清及TRIzol試劑購自Thermo Fisher公司，逆轉錄試劑購自Takara公司，CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1抗體購自Proteintech公司，TGF-β來源于R&D公司，CM-H2DCFDA、Mito-SOX染料購自Molecular Probes公司，2×實時熒光定量PCR mix購自Genecopoeia公司。實時熒光定量PCR儀購自BioRad公司，流式細胞分析儀購自Beckman公司。

1.2 細胞培養及處理 SK-OV-3細胞用含有10%胎牛血清的MyCoy′5A培養基培養，置于37 ℃、含5%CO2濕度培養箱中常規培養。將處于對數生長期的細胞用胰酶消化，計數后以3×105/孔的細胞密度均勻接種于6孔細胞培養板中，培養24 h后，分成兩組，觀察組用2 mL培養液+2 μL無血清DMEM配制的5 μg/mL TGF-β培養(最終濃度5 ng/mL)[9]，對照組直接加2 mL培養液，各組均為3個復孔，繼續培養24 h后，收集細胞，做后續的RNA提取，每組重復試驗3次。

1.3 細胞內總ROS、線粒體來源ROS檢測方法 按照說明書，將CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料加DMSO配制為10 mmol/L的儲液濃度，用37 ℃完全培養基稀釋1 000倍成為工作液；將培養的細胞棄掉原有的培養基，分別加入完全培養基稀釋完成的CM-H2DCFDA及Mito-SOX染料，避光，37 ℃培養箱中孵育20～30 min，棄去染料，用溫的PBS清洗1次，消化，用完全培養基終止，收集細胞，1 200 r/min離心，上流式細胞儀檢測熒光，CM-H2DCFDA用流式儀的FL1通道檢測，Mito-SOX用流式儀的FL2通道檢測，Flowjo 7.6軟件分析流式細胞儀所得的結果，結果以10 000個細胞熒光幾何平均值表示。

1.4 細胞EMT變化指標、線粒體復合體Ⅲ主要成分mRNA檢測方法 采用實時熒光定量PCR法。將6孔板中不同觀察組的細胞用PBS洗1次，加入1 mL TRIzol試劑裂解細胞，提取細胞內總RNA，測RNA濃度后，以oligodT逆轉錄引物，逆轉錄1 μg RNA為cDNA(反應條件為42 ℃、1 h，72 ℃、10 min)。以cDNA為模板，按2×SYBR實時熒光定量PCR mix的要求，在實時熒光定量PCR儀上擴增及檢測(反應條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s處檢測信號，循環40次；再65～95 ℃，每升高1 ℃收集1次熒光信號，做溶解曲線)。以GAPDH做為內參，2-ΔΔCT表示目的基因mRNA相對表達水平，ΔΔCT=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組。引物由武漢天一輝遠公司合成，序列見表1。

表1 各基因實時熒光定量PCR引物序列

1.5 細胞內線粒體復合體Ⅲ主要成分蛋白檢測方法 采用Western blotting法。收集不同處理條件的細胞，PBS清洗后，用RIPA裂解液裂解細胞蛋白，冰上裂解20 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，BAC法測蛋白，加5×loading buffer，90～100 ℃煮沸10 min后，SDS-PAGE檢測CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白。

2 結果

2.1 SK-OV-3細胞內總ROS產生量比較 觀察組及對照組總ROS產生量分別為3 159±42.92、1 062±24.41，兩組比較，P<0.05。

2.2 SK-OV-3細胞內線粒體來源ROS產生量比較 觀察組及對照組細胞內線粒體來源ROS產生量分別為1 254±29.04、1 039±17.32，兩組比較，P<0.05。

2.3 SK-OV-3細胞EMT變化指標比較 經過5 ng/mL TGF-β作用24 h后，SK-OV-3細胞發生明顯EMT變化，E-cadherin mRNA表達降低為對照組的0.20倍，N-cadherin、Vimentin、ZEB1分別是對照組的6.7398、4.4879、1.6395倍，P均<0.05。

2.4 SK-OV-3細胞內線粒體復合體Ⅲ主要成分mRNA比較 觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA表達水平較對照組改變倍數分別為0.89、1.04、1.09、0.87、1.17、1.18、0.92、1.09、1.07倍，P均>0.05。

2.5 SK-OV-3細胞內線粒體復合體Ⅲ主要成分蛋白比較 觀察組CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白水平較對照組改變倍數分別為1.01、0.97、1.07、0.99、1.03倍,P均>0.05。

3 討論

卵巢癌是影響女性健康的惡性腫瘤，其發病率位于女性惡性腫瘤的第3位，但病死率卻排名第一。而卵巢癌在發現時多數伴隨轉移，研究卵巢癌轉移過程中的變化對卵巢癌的診治有重要意義。TGF-β是EMT的誘導者，也是腫瘤發生轉移的調控因子，多種腫瘤都可以觀察到TGF-β水平上調。由于TGF-β通過誘導腫瘤發生EMT變化，進而促進腫瘤侵襲及轉移，因此TGF-β水平上調被認為是腫瘤進展的重要標志[12,13]。研究TGF-β在卵巢癌細胞發生EMT過程中細胞發生的改變，將提供卵巢癌診治方面的新視角。

近期研究表明，TGF-β誘導的ROS信號通路改變與TGF-β引起的EMT相關[7,14]，但TGF-β誘導細胞內ROS升高的機制尚不清楚。因此，深入研究TGF-β如何誘導細胞內ROS升高能更進一步明確腫瘤進展及轉移的機制。前期研究報道，細胞內ROS受多種因素調控，即NADPH氧化酶(Nox家族)、線粒體、過氧化物酶體、內質網、環氧合酶、細胞色素P450、黃嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶等，其中線粒體及Nox家族是細胞內ROS產生的主要來源[15]。前期研究顯示，過量ROS產生是TGF-β促進腫瘤發生EMT的原因之一，所以抑制TGF-β誘導產生ROS將是腫瘤治療的一個方面。因此，探索TGF-β誘導細胞ROS產生機制是目前的研究熱點之一。

本研究發現，TGF-β可以誘導SK-OV-3發生EMT變化，進而檢測細胞內總的ROS，發現細胞內總的ROS量明顯升高。雖然多數研究認為線粒體尤其是線粒體復合體Ⅲ是細胞內ROS產生的主要來源，但我們研究發現TGF-β并未改變細胞內線粒體來源的ROS產生量。進而我們檢測SK-OV-3細胞在TGF-β作用后線粒體復合體Ⅲ主要組分mRNA及蛋白表達水平的變化，結果顯示線粒體復合體Ⅲ主要組分CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCR10、UQCRB、UQCRFS1、UQCRH、UQCRQ mRNA及CYC1、TTC19、UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1蛋白表達并無明顯變化。因此，本研究證明TGF-β升高細胞內總的ROS并不來源于線粒體，TGF-β可能通過調控細胞內氧化-抗氧化平衡系統的關鍵酶從而改變細胞內的ROS，確切的生物學機制仍需進一步研究。

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武漢市衛生局臨床醫學科研項目(WX11B05)。

張慶華(E-mail： zhangqh66@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.31.008

R737.31

A

1002-266X(2017)31-0029-03

2016-10-12)