高親和力的人源化CD20單克隆抗體的研究進展

張倩倩 郭尚敬,2*

(1山東省聊城大學藥學院 252000； 2 山東省聊城大學農學院 252000)

據世界衛生組織統計，淋巴瘤發病率逐年增加，其中非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin′s lymphoma, NHL)是臨床最常見的淋巴系統惡性腫瘤。NHL占中國整個腫瘤發生的4%，死亡率居第14位[1～4]。對于這類惡性腫瘤，傳統的治療方式主要是放化療、骨髓移植或外周血造血干細胞移植等。然而，對于許多難治性、復發性及對化療和干細胞移植耐受力較差的患者而言，研發低毒性、更有效的靶向性治療方法顯得尤為重要。本文簡介抗CD20的單克隆抗體藥物，并綜述人源化CD20單克隆抗體親和力和免疫原性的研究進展。

1 抗CD20的單克隆抗體藥物

近年來，單克隆抗體及靶向治療NHL的臨床試驗研究取得了重大進展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單克隆抗體藥物[5]。CD20分子是一種B淋巴細胞表面的特異性膜蛋白，以非糖基化形式存在。CD20分子有4個跨膜區，氨基端和羧基端都位于細胞質內側，在第三跨膜區和第四跨膜區之間，有一個由43個氨基酸組成的環區(large loop)，構成其主要的抗原表位[6，7]。該抗原表位僅存在于前B細胞、成熟B細胞和超過95%的惡性B細胞表面，而不表達于造血干細胞、漿細胞和其他組織中，且其與抗體結合后無顯著內化和脫落，也不因與抗體結合而發生抗原調變，從而成為治療B細胞非霍奇金淋巴瘤的理想靶點[8]。

目前有多個以CD20為靶點治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物已被美國食品藥品管理局批準上市(表1)。這些CD20單抗與B細胞淋巴瘤表面抗原結合后，主要通過補體依賴的細胞毒作用(complement dependent cytotoxicity，CDC)以及抗體依賴細胞介導的細胞毒作用 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，直接誘導腫瘤細胞降解[9]。該藥可特異性地與B淋巴細胞表面的CD20 抗原結合，激發機體免疫反應，為B細胞NHL的治療提供了新的希望。

表1 FDA批準的治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物

2 單克隆抗體藥物的免疫原性

自1997年上市以來，利妥昔單抗(Rituximab)的銷售成果—直較好，2007年旳銷售額達到了22億美元，2012年增長到67億美元，毫無疑問地成為單克隆抗體藥物市場的主導藥物。但是，由于Rituximab是一種人鼠嵌合型的抗CD20抗體，抗體分子中仍然包含約30% 的鼠源序列，這類鼠源單克隆抗體進入人體后可能引起人抗鼠抗體免疫應答(HAMA)，導致無法長期用藥，嚴重制約Rituximab的使用。為此，需要降低該類藥物的免疫原性，并提高其抗腫瘤活性，達到增加藥效的目的。

從結構上看，Rituximab作為人鼠嵌合抗體，雖然含有人的Fc段，但抗體的重輕鏈可變區仍然是鼠源序列，分子中30%的氨基酸序列來源于鼠抗，仍被人體視為外源蛋白，具有免疫原性，誘發人體產生中和抗體，降低持續性用藥的治療效果。為進一步降低CD20抗體中鼠源序列的免疫原性，出現了以PDL公司的“complementarity-determining region，CDR”移植為主要手段的抗體人源化技術[10]。該技術將鼠抗的CDR區移接連入人抗體的框架區，從而減少鼠抗框架區導致的免疫原性。

盡管如此，這類抗體的人源化框架與鼠源性CDR區的氨基酸組合也可能被T細胞識別而引起免疫應答。T細胞對異源蛋白的識別主要由抗原呈遞細胞表面的MHC II與蛋白多肽結合后，呈遞給T細胞受體，進而活化淋巴細胞，產生免疫應答。因此，在設計選擇人源框架時，應盡可能降低其框架多肽與MHC II分子的結合，從而使人源化抗體的免疫應答降低到最小。張海峰(專利US 20130089540A1)采用獨特的抗體人源化技術，在鼠單抗2B8(Rituximab的原始鼠源單抗)的序列基礎之上，設計選擇了與MHC II結合位點少的人胚系(germline)抗體框架序列進行鼠源單抗2B8的人源化，大大減少了免疫原性，從而得到人源化的CD20抗體。通過該技術改造的人源化CD20抗體分子，表現出了較低的免疫原性。但因其未對該抗體的親和力進行任何修改，其殺傷腫瘤細胞的活性仍較低，仍需增加藥效提高其抗腫瘤活性，因此親和力的提高是非常必要的。

3 單克隆抗體藥物的親和力

抗體親和力是指抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型的結合強度。親和力越大表示抗體的結合反應越快，抗原抗體復合物越不易解離。親和力的高低是由抗原分子的大小以及抗體分子的結合位點與抗原決定簇之間立體構型的合適度決定的。對于高度表達CD20的B細胞惡性淋巴瘤，Rituximab的臨床療效已得到肯定，但其臨床反應率僅50%左右，完全緩解率只有10%[11]。隨著治療應用的推廣，仍不斷發現難以治愈的惡性淋巴瘤病例，且該類腫瘤一旦復發，其耐藥再治療的緩解率極低，為此需要不斷提高單克隆抗體的親和力，從而提高其抗腫瘤的活性。

迄今為止，提高抗體親和力的方法主要是以原親本單抗為改造模板，通過構建其突變體抗體庫(如核糖體展示、酵母雜交、噬菌體展示文庫等)進行篩選，最終獲得更高親和力的單克隆抗體。但以上這些技術都具有各自的局限性：如難以構建能覆蓋所有位點、可以突變成任何氨基酸的抗體文庫；構建抗體庫及篩選過程費時、費力、費財等。近年來，應用計算機模擬突變方法提高抗體親和力的技術，已成為該領域的熱點。趙磊等在前期得到的Rituximab/CD20抗原肽共結晶的基礎上，通過基于抗體進化規律的計算機輔助設計，將重鏈可變區57位天冬氨酸和102位酪氨酸分別突變成谷氨酸和賴氨酸，將輕鏈可變區93位天冬酰胺突變成精氨酸，使Rituximab的親和力提高了15.47倍。盡管該三點組合突變體極大地提高了抗體的親和力，但由于其整個可變區都是異源的，在進行臨床試用時仍能夠被人體的免疫系統識別而產生人抗鼠抗體(HAMA)反應，因此有必要對鼠單抗可變區作進一步的人源化改造。

4 展望

進行抗體的人源化有兩個基本原則，即保持或提高抗體的親和力和特異性，以及大大降低或基本消除抗體的免疫原性。但是目前為止，CD20抗體的人源化與親和力的提高都是分別進行的，還沒有發現將這兩者同時進行的設計與改造，從而獲得既有低免疫原性又有高親和力的抗體藥物。開發既有低免疫原性又有高親和力的抗體藥物，不僅具有重要的理論價值，而且具有巨大的應用前景。