LAMP技術在水體病原微生物檢測中的應用

尹紅果，方福如，商 栩

(1.湖南環境生物職業技術學院 醫學院，湖南 衡陽 421005； 2.溫州醫科大學 浙南水科學研究院，浙江 溫州 325035)

LAMP技術在水體病原微生物檢測中的應用

尹紅果1，方福如1，商 栩2

(1.湖南環境生物職業技術學院 醫學院，湖南 衡陽 421005； 2.溫州醫科大學 浙南水科學研究院，浙江 溫州 325035)

為了探究LAMP技術在水體病原微生物檢測中的應用情況，利用該技術對環境水體常見細菌類病原體進行研究。針對水體常見病原微生物的特異基因設計引物，建立環介導等溫擴增快速檢測方法，選擇目標病原微生物并考查其在水環境中的分布特征及豐度情況。結果表明，沙門菌存活量在所研究區域范圍內達到一定豐度，且分布特點顯著，各站位沙門菌濃度大致為2.39×10～2.39×105mL-1。表明LAMP方法能夠有效運用于水體病原微生物的快速檢測，為環境水體中病原微生物的選擇和檢測提供了一種實用、便捷的手段。

環介導等溫擴增； 病原微生物； 環境水體

病原微生物污染及其對人類健康的危害是當今最受關注的全球性環境問題之一，其中由于水環境受污染或經水傳播而引起的病原體感染尤為突出[1]。目前，介水傳播引起的腸道傳染病仍是我國急性傳染病中發病數最多、流行面最廣、影響群眾生活生產最普遍的一類疾病[2]。盡管預防介水傳染病一直是衛生防疫機構的關注重點，但對城鄉各類地表水體受相關病原微生物污染的狀況卻知之甚少。針對傳統病原微生物檢測方法費時費力、檢出特異性和準確性偏低的問題，開展基于分子生物學技術的快速檢測工作為大勢所趨。環介導等溫擴增技術(LAMP技術)是2000年日本學者Notomi等報道的一種恒溫核酸擴增方法，該方法主要針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在等溫條件下(約65 ℃)進行反應，1 h內就能將靶序列DNA擴增109倍。該技術以其簡單、快捷、特異性強、敏感性高、不需要昂貴的實驗儀器設備等優點，在分子生物學領域備受關注[3-5]。目前，LAMP方法已經被廣泛應用于不同領域的多種病原微生物檢測[6-7]。本研究擬運用環介導等溫擴增技術對水環境中常見病原微生物進行檢測，并對目標水域主要病原菌沙門菌的分布特點及豐度值進行探究，以期實現水體中沙門菌污染情況的快速定量檢測，從而為介水傳染病的防控提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LA-302C實時濁度儀(日本榮研生物科技有限公司)，5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，YXQ-LS-50SⅡ型高壓滅菌器(上海博訊實業有限公司)，DK-600型恒溫水浴箱(上海精宏試驗設備有限公司)。AxyPrep細菌基因組DNA試劑盒、BstDNA聚合酶、dNTPs、10×loading buffer、DNA Marker DL100、溴化乙錠(紐英倫生物技術有限公司)，水體DNA提取試劑盒(美國Omage公司)。

1.2 樣品處理

本研究于溫瑞塘河40個常規站位中選取5個典型站位，其中，A3位于兩河相匯處；B7與常有污水注入的甌江相通；B15周圍是學校、醫院等人口集中的場所；C1處在生活區，水質黑臭；W3位于三垟濕地。每月定時按微生物取樣方法(GB/T 5750.12—2006)采取水樣1 000 mL。然后于實驗室準確量取水樣500 mL，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，再用水體DNA提取試劑盒提取水中微生物的DNA，得到各基因組樣品，放入冰箱(-20 ℃)備用。

1.3 引物設計

1.3.1 引物的選擇

通過文獻查閱和LAMP引物設計軟件進行引物篩選，目標病原菌的特異性基因引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。隱孢子蟲的引物序列：FIP 5′-TTGCGCCCTGTTAATCCAGCATT AATTAATCCATCTGGCAGRTTT-3′，BIP 5′-TTGTAG ATACATACGGAGGATGGGTCTACTTTAGTTGCATCT TTCC-3′，F3 5′-ATTTGAT RGACAAAGAAACTAG-3′，B3 5′-CGATTGACTTTGCAACAAG。彎曲桿菌的引物序列：FIP 5′-ACAGCACCGCCACCTATAGTAG AAGCTTTTTTAAACTAGGGC-3′，BIP 5′-AGGCAGC AGAACTTACGCATTGAGTTTGAAAAAACATTCTACC TCT-3′，F3 5′-GCAAGACAATATTATTGATCGC-3′，B3 5′-CTTTCACAGGCTGCACTT。腸球菌的引物序列：FIP 5′-CACTTTTTGTTGTTGGTTTTCGCTTTATT ATCTGCTTGGGGTGC-3′，BIP 5′-ATCTGCAGACAA AGTAGTAATTGCTCCAAGCTTTTAAGCGTGTC-3′，F3 5′-GCCGGAAATCGATGAAGA-3′，B3 5′-TCCA GCAACGTTGATTGT。大腸桿菌O157：H7的引物序列：FIP 5′-CTCTCTTTCCTCTGCGGTCC-GATGTT TTTCACACTTATTGGAT C-3′，BIP 5′-TAAGGAATC ACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT-3′，F3 5′-AACAGTCTTGTACAAGTCCA-3′，B3 5′-GGTGCTTTTGATATTTTTCCG。沙門菌的引物序列：FIP 5′-GGCGTGAGAGATCCACCTGGAATGCGCCGT AATAGCGGTC-3′，BIP 5′-CACCATTATGGAAACGC TTATCCGCCGGATACAGCTGAAGCATC-3′，F3 5′-GCCATTCCACATCGAAGAGGT-3′，B3 5′-ATGAGA ACATCAATGGTATGGC。外引物(F3/B3)、內引物(FIP/BIP)濃度分別配制成5 pmoL·L-1、40 pmoL·L-1。

1.3.2 LAMP反應體系與擴增條件

反應體系(25 μL)包括內引物(FIP和BIP)各0.4 μL，外引物(F3和B3)各0.5 μL，RM 12.5 μL，BstDNA聚合酶1 μL，染料1 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水6.7 μL，礦物油1滴。沙門菌和大腸桿菌O157：H7均于65 ℃擴增60 min，隱孢子蟲和彎曲桿菌均于63 ℃擴增60 min，腸球菌在66 ℃擴增60 min，擴增后各種病原微生物分別在80 ℃孵化10 min。

1.3.3 結果判定

利用實時濁度儀實時監測LAMP核酸擴增反應過程，以直觀的圖文形式來顯示整個反應過程中各個反應的速率和時間。當LAMP實時終點監控濁度儀分析線性圖的線性峰值超過預定標準或柱形圖底部顯示紅色柱形時，反應結果即為陽性，藍色柱高度代表反應生成的產物量，數值越高表示產物量越大。

2 結果與分析

2.1 病原微生物LAMP擴增結果及選擇

除陽性對照樣品和沙門菌實際水樣檢測顯示陽性結果，隱孢子蟲、彎曲桿菌、腸球菌和大腸桿菌O157：H7的實際水樣相對應的柱形圖幾乎未出現峰值，即均未被檢出(圖1)。初步斷定所選擇的采樣點中這些病原菌可能含量極少，甚至不存在。水體病原菌一般并非水中固有菌，而是從外界污染而來，特別是人畜糞便的污染[8]。本研究采樣站位多處于醫院、生活區等人口密集的地方，導致沙門菌檢出率較高，沙門菌在水域中達到一定豐度，勢必對附近居民的健康產生一定的安全隱患，所以其分布情況值得研究。

2.2 沙門菌分布情況

按優化好的LAMP反應體系，對4—12月提取的各特定站位水體基因組DNA進行擴增分析，以檢測水體中沙門菌的分布狀況。各個月份沙門菌陽性檢出率的變化趨勢如圖2所示，從4月開始，沙門菌大量生長繁殖，6—7月豐度達到最大，8月數量銳減后又再次生長繁殖。由于本研究區域高溫月份持續時間較長，雨水偏多，而沙門菌與溫度和降雨呈正相關[9]，再結合沙門菌在環境中存活持久性特點[10]，該檢出結果是符合沙門菌生活習性的。Rudolfs等[11]的研究結果表明，水體微生物有再生長趨向，因而8月檢出率呈現驟降，9—12月檢出率再次升高。

2.3 沙門菌LAMP定量分析

針對B7、C1站位，選擇溫差較大的夏冬兩季取水樣，分別進行沙門菌LAMP定量分析。研究以各個站位實際水樣(500 mL)為基準提取基因組，然后以原始濃度為參考，分別對各基因組樣品進行10倍梯度逐級稀釋，按優化好的LAMP反應體系進行最低濃度檢測，以確定各樣品在何濃度時不被檢出，結果如圖3、圖4所示。從沙門菌的陽性檢出率結果可以看出，B7站位的微生物基因組豐度比C1站位低2個數量級及以上，B7站位的水樣在夏季最低檢出限為起始濃度稀釋10倍，而冬季的最低檢出限為起始濃度，進一步稀釋便檢測不出；C1站位的沙門菌最低檢出限在夏季為起始濃度稀釋10 000倍，而冬季則為起始濃度稀釋100倍。

圖2 沙門菌陽性檢出率

1，B7 10倍稀釋濃度(10-1)；2，B7 100倍稀釋濃度(10-2 )；3，B7 1 000倍稀釋濃度(10-3)；6，C1 104倍稀釋濃度(10-4)；7，C1 105倍稀釋濃度(10-5)；8，C1 106倍稀釋濃度(10-6)圖3 夏季B7、C1站位沙門菌的最低檢出限

1，B7未稀釋(100)；2，B7 10倍稀釋濃度(10-1)；3，B7 100倍稀釋濃度(10-2)；6，C1 100稀釋濃度(10-2)；7，C1 1 000稀釋濃度(10-3)圖4 冬季B7、C1站位沙門菌的最低檢出限

環境加標水樣中沙門菌的最低檢出限為2.39×10 mL-1[12]，由此可以得出，夏季B7站位沙門菌的數量大于或者等于2.39×102mL-1，C1站位沙門菌的數量大于或者等于2.39×105mL-1；冬季，B7站位沙門菌的數量大于或者等于2.39×10 mL-1，C1站位沙門菌的數量大于或者等于2.39×103mL-1。又因為其他站位的濃度含量介于兩者之間，因此可以推出其他研究站位沙門菌的濃度介于2.39×10～2.39×105mL-1。

3 小結

本研究針對環境水體中常見病原微生物建立了環介導等溫擴增方法，有效避免了傳統微生物檢測方法費時費力、檢出特異性和準確性偏低的問題。在已有的研究基礎上，通過對特定區域主要病原微生物存在情況進行探究，進一步證實了該研究方法的快速高效和準確性。為了凸顯LAMP技術在環境微生物檢測中的實用性，本研究進一步對區域主要病原菌沙門菌的分布規律及豐度進行了調查，從檢測結果看，沙門菌在所研究區域分布特點顯著，其濃度介于2.39×10～2.39×105mL-1，表明LAMP方法能夠有效應用于環境水體中病原微生物的快速檢測。

[1] ROSZAK D B, COLWELL R R. Survival strategies of bacteria in the natural environment [J]. Microbiological Reviews, 1987, 51(3): 365-379.

[2] 周德慶. 微生物學教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2005.

[3] NOTOMI T, OKAYAMA H, MASUBUCHI H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research, 2000, 28(12): E63.

[4] 匡燕云, 李思光, 羅玉萍. 環介導等溫擴增核酸技術及其應用[J]. 微生物學通報, 2007, 34(3): 557-560.

[5] MORI Y, NAGAMINE K, TOMITA N, et al. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2001, 289(1): 150-154.

[6] SONG T, TOMA C, NAKASONE N, et al. Sensitive and rapid detection ofShigellaand enteroinvasiveEscherichiacoliby a loop-mediated isothermal amplification method [J]. FEMS Microbiology Letters, 2005, 243(1): 259-263.

[7] MARUYAMA F, KENZAKA T, YAMAGUCHI N, et al. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loop-mediated isothermal amplification [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 5023-5028.

[8] 謝曉東, 蔣蓉芳, 宋偉民. 蝎形引物PCR快速檢測環境水樣中沙門菌方法研究[J]. 環境與職業醫學, 2003, 20(2): 115-119.

[9] HALEY B J, COLE D J, LIPP E K. Distribution, diversity, and seasonally of waterborne salmonellae in a rural watershed [J]. Applied & Environmental Microbiology, 2009, 75(5): 1248-1255.

[10] THOMAS J L, SLAWSON R M, TAYLOR W D. Salmonella serotype diversity and seasonality in urban and rural streams [J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114(3): 907-922.

[11] RUDOLFS W, GEHM H W. Sewage chlorination studies [M]. New Jersey: New Jersey Agricultural Experiment Station, 1936.

[12] 尹紅果, 馬小雪, 商栩, 等. 環境水體中沙門菌環介導等溫擴增快速檢測方法[J]. 環境與健康雜志, 2013, 30(2): 146-149.

(責任編輯：侯春曉)

2017-05-12

湖南環境生物職業技術學院院長科研青年基金(ZK2016-02)

尹紅果(1987—)，女，湖南岳陽人，助教，碩士，從事微生物分子生態學研究工作，E-mail:hongguoyin@126.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170844

X172

A

0528-9017(2017)08-1440-04

文獻著錄格式：尹紅果，方福如，商栩. LAMP技術在水體病原微生物檢測中的應用[J].浙江農業科學，2017，58(8)：1440-1443.