手性拆分2-溴丙酸甲酯的菌株篩選及優化

魏盼盼，陸躍樂，陳小龍

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

手性拆分2-溴丙酸甲酯的菌株篩選及優化

魏盼盼，陸躍樂，陳小龍*

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

2-溴丙酸甲酯是一種重要的農藥中間體，其光學純構型可用于多種手性農藥的合成。該研究從自然界篩選出可以選擇性水解拆分2-溴丙酸甲酯的菌株，并對此菌株進行菌種鑒定和發酵培養基優化，最終通過全細胞催化獲得R-2-溴丙酸甲酯。經鑒定，該S-型水解酶菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，對映體過量值達85%以上。經單因素和正交試驗分析，確定該菌株最佳培養基成分為麥芽糖20 g·L-1，蛋白胨30 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，玉米油10 mL·L-1。最終脂肪酶活性為優化前的1.64倍，該方法可為多種手性農藥單一對映異構體的合成提供初始光學純原料，從而降低生產成本，并利于農藥減量使用。

手性農藥；R-2-溴丙酸甲酯； 不對稱水解； 生物催化

苯氧羧酸類除草劑是一類最早實現工業化的手性除草劑，如精噁唑禾草靈等，此類除草劑具備毒性低、活性高、安全等一系列優點[1-2]。在如今的農藥市場上，高純度異構體作為除草劑其市場占有率超過50%[3]，此類除草劑的R構型活性遠遠高于S構型活性[4]。單一使用R型苯氧羧酸類除草劑不僅可以節約成本，減少資源使用，也可以降低對環境造成的傷害。而現今農藥市場上單一構型苯氧羧酸類除草劑，價格較為昂貴，若能高效廉價獲得R型苯氧羧酸類除草劑將會推進除草劑行業迅猛發展。獲得單一構型苯氧羧酸類除草劑主要是通過2個途徑：提高R-對羥基苯氧基乳酸/酯的合成效率和增加鹵代2-丙酸/酯的光學純度[5]。

2-溴丙酸甲酯，在有機化學中屬于合成原料，并且是苯氧羧酸類除草劑禾草靈、吡氟禾草靈、禾草克等一系列除草劑的重要中間體。目前，獲得單一構型2-溴丙酸甲酯的方法主要為化學合成[6]和生物拆分法。曹雪榮等[7]采用固定化柱狀假絲酵母脂肪酶的方法，獲得了單一構型2-溴丙酸甲酯，其ee值達到90%以上。Tasnádi等[8]通過構建工程菌高產還原酶，將β-鹵代丙烯酸酯衍生物脫鹵還原成R-2-溴丙酸甲酯，該對映體過量值高達96%。現有利用酶法拆分獲得單一構型的方法主要局限于固定化酶或者是工程菌中，兩者的立體選擇性高，但是固定化酶前期步驟繁瑣，工程菌不穩定，不適合工業化生產。

本研究從自然界土壤中篩選具有選擇性降解2-溴丙酸甲酯能力的菌株并且對其進行鑒定和發酵培養基優化，進一步提高催化效率。

1 材料與方法

1.1 菌株

從土壤中篩選出可水解拆分2-溴丙酸甲酯的菌株，篩選ees值最高菌株，命名為Fer-ly-16。

1.2 培養基

種子培養基。蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH值 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵基礎培養基。蛋白胨10 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，橄欖油10 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，pH 值7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

富集培養基。蛋白胨 10 g·L-1，無水K2HPO41 g·L-1，無水MgSO40.5 g·L-1，底物100 μL，pH值7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

初篩培養基。橄欖油10 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1，無水K2HPO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

復篩培養基。蛋白胨10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，橄欖油10 g·L-1，無水K2HPO41 g·L-1，pH 值7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 試劑及溶液配制

Rac-2-溴丙酸甲酯(分析純)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

PVA橄欖油乳化液的制備。取20 g聚乙烯醇(PVA)，加入800 mL去離子水，加熱，不斷攪拌使其完全溶解，用0.1 mol·L-1NaOH調pH值至7.0，過濾后，定容至1 000 mL，配置成2%聚乙烯醇(PVA)溶液。取上述溶液300 mL，加入100 mL橄欖油，高速勻漿機高速攪拌成乳白色液體，無油狀物質即可(乳化液現配現用)。

0.1 mol·L-1pH值 7.0的磷酸鈉緩沖液配制方法參考http://www.biomart.cn/experiment/430/478/479/28726.htm。

1.4 儀器

氣相色譜儀(FULI 9790)，高速冷凍離心機(長沙湘智)，恒溫培養箱(DNP-9082)，恒溫調速回轉式搖床(DKY-1)，光學顯微鏡(奧林巴斯CH-20)。

1.5 方法

1.5.1 產脂肪酶菌株的篩選

富集培養。將50 mL滅菌生理鹽水倒入250 mL錐形瓶中，再加入5 g土樣，將錐形瓶置于30 ℃，180 r·min-1搖床中，1 h后取出，靜置30 min；取1 mL上清于富集培養基中，30 ℃，180 r·min-1搖床培養4 d；取1 mL 4 d后培養的菌液于富集培養基，為第2次富集；如此富集培養3次。

平板篩選。取富集后的菌液進行稀釋，稀釋濃度為10-8、10-10、10-12、10-14，取以上4個濃度的菌液各100 μL，涂布于初篩固體培養基中，每個濃度做3組。置于30 ℃培養箱，恒溫培養直至有菌落產生。將平板置于365 nm紫外下，挑取有熒光產生的菌落，將此類菌落挑取劃線于新初篩固體平板中，劃線純化，保存于斜面培養基中。

復篩篩選。將斜面培養基中菌落接種于種子培養基中，培養12～16 h，取1 mL種子液培養基于復篩液體培養基中，30 ℃，180 r·min-1，培養48 h，得到50 mL發酵液。取發酵液，4 ℃ 8 000g離心20 min，去掉上清得到菌體，加入10 mL 0.1 mol·L-1pH值7.0的磷酸鈉緩沖液，加入100 μL底物，30 ℃，180 r·min-1進行反應，根據固定化酶對底物反應時間[7]，在4 h時停止反應，進行處理。

1.5.2 菌株活化及菌株發酵培養

菌株劃線于LB平板，過夜培養，挑取單菌落于LB液體培養基中，過夜培養，接種于發酵培養基中，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養48 h，得到50 mL發酵液。

1.5.3 菌體及上清液催化水解反應

取50 mL發酵液，4 ℃，8 000g離心20 min，去除上清液，得到全細胞，加入10 mL 0.1 mol·L-1pH 值7.0的磷酸鈉緩沖液，然后加入100 μL底物，將10 mL反應液放于30 ℃水浴搖床中反應。每隔2 h取1 mL反應液，加入0.1 mol·L-1HCl，直至反應液pH值為2，加入等體積乙酸乙酯，放入搖床內完全萃取，取上清液500 μL，加入少量無水硫酸鈉除水，14 000g，離心1 min后，取上清液200 μL進樣檢測。

1.5.4 檢測方法

氣相色譜條件載氣為氮氣，檢測器210 ℃，進樣器210 ℃。升溫程序：80 ℃，1 min；以10 ℃·min-1升溫至160 ℃；160 ℃，2 min；以6 ℃·min-1升溫至180 ℃；180 ℃，1 min；以10 ℃·min-1升溫至190 ℃；190 ℃，降溫。進樣量2 μL，氣相柱為BGB-174毛細管手性色譜柱。

底物對映體過量值(ees)和酯轉化率(C)按下列公式計算：

ees=│([S]S-[S]R)/([S]S+[S]R)│×100。

C=([S]SA+[S]RA- [S]S-[S]R)/([S]SA+[S]RA)。

式中：[S]S和[S]R是樣品中S構型和R構型含量，ees為底物對映體過量值；[S]SA和[S]RA為未催化前樣品中S構型和R構型含量，C為酯轉化率。

1.5.5 產脂肪酶菌株鑒定

選取對底物有效果的菌株進行生理生化鑒定，將挑取的單菌落接種于LB培養基，并劃線于LB固體平板中，培養16 h后，觀察平板中菌落，將菌液稀釋后進行革蘭氏染色。將單菌落接種于LB液體培養基，30 ℃培養16 h，隔2 h取樣，測其生長曲線。取單菌落接種于LB液體培養基，30 ℃ 180 r·min-1振蕩培養16 h后，進行16S rDNA分子鑒定。

1.5.6 發酵培養基優化及發酵條件優化

以發酵培養基為基礎，設計碳源(1%添加量，蔗糖、麥芽糖、甘露醇、橄欖油、殼聚糖、可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖以及不加碳源)、氮源(1%添加量，蛋白胨、氨水、大豆分離蛋白、黃豆粉、酵母提取物、硫酸銨、氯化銨、脫脂豆粉、玉米粉)、無機鹽(0.1%添加量，KH2PO4、K2HPO4、Na2S2O3、MnSO4、Na2SO4、NaCl、ZnSO4、AgNO3、CaCl2、CoCl2、CuSO4、EDTA、FeCl3、FeSO4、MgSO4·7H2O)、誘導劑(吐溫-80、玉米油、橄欖油、底物)各個單因素，對培養基中各個因素進行單因素優化，確定各個因素的最佳濃度。在單因素優化的基礎上，進行正交實驗，考查麥芽糖(A)、蛋白胨(B)、無機鹽(MgSO4·7H2O和NaCl的濃度)(C，D)和玉米油(E)5個因素，每個因素選取4個水平：麥芽糖(A)和蛋白胨(B)的4個水平均分別為5、10、20、30 g·L-1；MgSO4·7H2O和NaCl的4個水平均分別為0.2、0.5、1、2 g·L-1；玉米油的4個水平分別為4、10、20、40 mL·L-1。

1.5.7 酶活性測定

脂肪酶活性單位定義為30 ℃、pH值為7.0條件下，以每1 min消耗1 μg 2-溴丙酸甲酯所需酶量為1個活性單位(U)。

相對脂肪酶活性。以初發酵培養基pH 值7.0，30 ℃發酵48 h為基礎，50 mL發酵液離心得到菌體加10 mL磷酸緩沖液，加入100 μL底物，水浴搖床30 ℃反應4 h，氣相檢測剩余底物量，計算酯轉化率，將該轉化率定為脂肪酶活性100%。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

通過富集培養、初篩培養以及復篩培養后，總共獲得65株產脂肪酶菌株，其中有11株菌株對2-溴丙酸甲酯有拆分作用，有1株菌株對于2-溴丙酸甲酯的拆分選擇性比較高，將其命名為Fer-ly-16；其ees值大于85%。

2.2 催化水解反應

Fer-ly-16 菌株發酵液離心后得到全細胞，取全細胞作為酶催化劑，反應4 h，結果如圖1所示。以全細胞作為催化劑，反應4 h以后，底物的2種構型有很大差距，其ees大約為85%，酯轉化率約為40%。

圖1 全細胞催化拆分底物

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌落特征

Fer-ly-16單菌落背面為乳白色，正面凸起，表面粗糙，桿狀，革蘭陽性菌。生長曲線表明，0～3 h處于停滯期，4～10 h為指數生長期，10～16 h為平臺期，17 h后進入衰亡期。

2.3.2 16S rDNA分子鑒定

測序得到其16S rDNA全長約為1 400 bp，序列比對結果表明，該菌株與Bacillussubtilis27R7-12、B.subtilissubsp. subtilis strain QB5413和B.subtilissubsp. subtilis strain QB5412的同源性高于99%。根據菌落形態、革蘭氏染色結果、序列比對以及系統進化樹結果(圖2)，Fer-ly-16菌株屬于枯草芽孢桿菌。

小數為枝長，枝上顯示Bootstrap500個循環的置信度圖2 基于16S rDNA序列的系統發育樹

2.4 發酵培養基優化

2.4.1 碳源優化

從圖3中看出，以麥芽糖為碳源時，其脂肪酶活性最大，而以殼聚糖為碳源時，其脂肪酶活性最低，表明Fer-ly-16菌株不適合以殼聚糖為碳源，最適碳源為麥芽糖。以麥芽糖為碳源，當麥芽糖濃度為15 g·L-1時，其脂肪酶相對活性最高，達到110%；麥芽糖濃度超過15 g·L-1時，相對酶活性逐漸降低，表明麥芽糖濃度的增加在一定程度上抑制了菌體的生長。

圖3 不同碳源及最優碳源濃度對菌株Fer-ly-16發酵產酶的影響

2.4.2 氮源優化

由圖4可以看出，以蛋白胨為氮源，菌株酶活性最大；而以氨水、硫酸銨、氯化銨為氮源時，菌株相對酶活性幾乎為0。因此，Fer-ly-16菌株最適氮源為蛋白胨。蛋白胨濃度為20 g·L-1時，脂肪酶相對酶活性達到最大。推測高濃度的氮源可能會使菌體細胞發生破裂，從而使酶合成受到抑制，降低酶活性。

圖4 不同氮源及最優氮源濃度對菌株Fer-ly-16發酵產酶的影響

2.4.3 無機鹽優化

從圖5可知，添加NaCl或MgSO4·7H2O的培養基，脂肪酶相對酶活比較高，分別為100%和110%。當培養基中添加ZnSO4和CoCl2時，這2種無機鹽可能對細胞生長產生抑制作用，菌體的相對酶活性幾乎為0。因此，Fer-ly-16菌株發酵培養基的最適無機鹽為NaCl或MgSO4·7H2O。在最適無機鹽離子的基礎上，考查不同濃度的無機鹽離子對脂肪酶相對活性的影響。MgSO4·7H2O和NaCl分別為0.2和1 g·L-1時，其脂肪酶活性達到最大值。

2.4.4 誘導劑優化

從圖6可以看出，以玉米油為誘導劑時，其脂肪酶相對活性達到最大，以添加底物為誘導劑時，其脂肪酶相對活性幾乎為0。因此，Fer-ly-16菌株發酵培養基的最適誘導劑為玉米油，當玉米油添加量為30 mL·L-1時，其脂肪酶相對活性最大。

2.4.5 正交實驗結果

由表1可知，A3B4C2D3E2為最佳水平組合，即麥芽糖20 g·L-1，蛋白胨30 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，玉米油10 mL·L-1。極差分析表明，氮源對脂肪酶活性影響最大，其次是MgSO4·7H2O，影響最小的是碳源。取組合A3B4C2D3E2為最佳培養基組合，發酵培養48 h后，催化反應后相對酶活性為164%。

圖5 不同無機鹽及最優無機鹽濃度對菌株Fer-ly-16發酵產酶的影響

圖6 不同誘導劑及最優誘導劑濃度對菌株Fer-ly-16發酵產酶的影響

組合因素碳源氮源MgSO4·7H2ONaCl玉米油相對酶活性/%111111102.89212222121.82313333127.64414444130.61521234108.23622143101.68723412129.63824321129.71931342108.301032431122.031133124124.221234213129.211341423105.651442314116.371543241130.681644132128.08K1120.7106.3114.2119.5121.3K2117.3115.5122.5120.4122.0K3120.9128.0120.5121.5116.0K4120.2129.4122.0117.8119.9R3.623.18.33.76.0

3 小結

本研究篩選出1株可以高效水解拆分2-溴丙酸甲酯的菌株Fer-ly-16，經單菌落觀察和16S rDNA分子鑒定可知，此菌株為枯草芽孢桿菌。30 ℃發酵48 h后，離心得到全細胞，該全細胞可在30 ℃下催化100 μL 2-溴丙酸甲酯，其ees達到85%，剩余底物為R-2-溴丙酸甲酯，并且可產生S-2-溴丙酸。

對菌株Fer-ly-16發酵培養基進行優化，培養基中氮源對脂肪酶活性影響最大。優化后的培養基為麥芽糖20 g·L-1，蛋白胨30 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，玉米油10 mL·L-1，此培養基得到的脂肪酶活性為基礎培養基酶活性的1.64倍，具有較好的工業應用前景。

[1] 江紫薇, 譚琳, 譚濟才, 等. 苯氧羧酸類除草劑的微生物降解研究進展[J]. 農藥, 2012, 51(5): 323-326.

[2] ZAOUAK A, MATOUSSI F, DACHRAOUI M. Electrochemical degradation of a chlorophenoxy propionic acid derivative used as an herbicide at boron-doped diamond [J]. Desalination & Water Treatment, 2014, 52(7): 1662-1668.

[3] 鄭卓. 手性農藥與手性技術[J]. 精細與專用化學品, 2001 (23/24): 1-4.

[4] HAVALDAR F H, PATIL A R. Synthesis of biologically active 1-[2-(2-methyl-5-nitroimidazol-1-yl) acetyl]-3-substituted phenyl-4-carbaldehyde-1H-pyrazoles [J]. Asian Journal of Chemistry, 2008, 20(1): 97-101.

[5] 包文娟, 吳永果, 毛春暉, 等. 芳氧苯氧羧酸類旋光性除草劑的研究進展[J]. 精細化工中間體, 2007, 37(4): 36-38.

[6] SUN Z, PENG X, DONG X, et al. Highly selective synthesis of α-bromoesters using molecular bromine catalyzed by phosphorus [J]. Research Gate, 2012, 24(2): 929-930.

[7] 曹雪榮, 梁瑩瑩, 薛屏. 固定化柱狀假絲酵母脂肪酶的制備與催化性能的研究[J]. 寧夏大學學報(自然科學版), 2010, 31(4): 351-355.

(責任編輯：侯春曉)

2017-03-09

魏盼盼(1992—)，女，浙江余姚人，碩士研究生，主要從事酶工程研究工作，E-mail：weihangchen@163.com。

陳小龍(1970—)，男，浙江仙居人，教授，博士，從事生物農藥的結構修飾與生物催化制備手性農藥研究工作，E-mail：richard_chen@zjut.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170839

S482.4+1

A

0528-9017(2017)08-1420-05

文獻著錄格式：魏盼盼，陸躍樂，陳小龍. 手性拆分2-溴丙酸甲酯的菌株篩選及優化[J].浙江農業科學，2017，58(8)：1420-1424，1428.