白芨種子萌發(fā)形態(tài)學(xué)觀察及組培快繁體系的建立

席剛俊，李警保，韓正敏*，史 俊，賈 君

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400； 2.南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

白芨種子萌發(fā)形態(tài)學(xué)觀察及組培快繁體系的建立

席剛俊1，李警保2，韓正敏1*，史 俊1，賈 君1

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400； 2.南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)

為了建立白芨的組培快繁體系，在實驗室條件下，利用顯微鏡對白芨種子的萌發(fā)過程進行了觀察，同時針對白芨無菌種子萌發(fā)、叢生芽增殖和壯苗生根各階段，篩選較適宜的培養(yǎng)基類型、激素種類和含量、添加劑種類和用量。結(jié)果表明，白芨種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育被劃分為5個階段，以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0.5 mg·L-16-BA、0.2 mg·L-1NAA及200 g·L-1土豆泥，萌發(fā)率可達83.47%±3.11%；基本培養(yǎng)基中添加10 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA、75 g·L-1香蕉泥和100 mL·L-1椰子汁，適合白芨幼苗壯苗生根。

白芨； 組織培養(yǎng)； 萌發(fā)率； 叢生芽； 生根

白芨是蘭科白芨屬多年生草本植物，是溫帶地生蘭科植物中最具有經(jīng)濟價值的類群之一，其塊莖為我國傳統(tǒng)名貴的中藥，花色艷麗，也是一種很好的景觀植物。白芨喜溫暖、陰濕的環(huán)境，分布較廣，主產(chǎn)于貴州、四川、湖南、湖北、安徽、江蘇、河南、云南、廣西、浙江等省區(qū)[1]。白芨鱗莖入藥，性平、味苦，民間常將其作為膠黏性止血劑，用于補肺、生肌、祛痰、止血，治療吐血、肺病、咳血、慢性胃潰瘍等[2-3]。白芨中含量較高的白芨膠可以替代阿拉伯膠等膠劑作為混懸劑及乳化劑，可廣泛用于食品及化工領(lǐng)域[4-5]。近年來，隨著白芨價格的提高，我國大部分地區(qū)的野生白芨遭到過度采挖，導(dǎo)致其野生自然資源急劇減少，瀕臨滅絕，被國家列為重點保護野生藥用植物之一，屬瀕危植物[6]，同時也被列入《瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約》(CITES)保護種類[1]。長期以來，白芨處于就地采收、就地留種、就地栽培這樣的簡單循環(huán)狀態(tài)。白芨種子發(fā)育不完全，在自然條件下很難萌發(fā)和生長，一般靠分株繁殖，很難滿足大量栽培的需要，通過組培快繁技術(shù)可以規(guī)模化繁殖白芨種苗，滿足白芨規(guī)模化種植的需要[7-11]。

本文以白芨種子為材料，觀察了白芨種子在萌發(fā)過程的形態(tài)學(xué)變化，同時探討了不同因素對白芨種子萌發(fā)和壯苗生根的影響，初步建立了白芨種苗的組培快繁體系。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟未開裂的白芨蒴果，于2014年9月采自四川雅安，2014年10月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院組培實驗室進行組培試驗。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)形態(tài)學(xué)觀察

將野外采集的蒴果在自來水下沖洗干凈，在無菌條件下經(jīng)75%乙醇浸泡40 s，無菌水沖洗2～3次，2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干蒴果表面的水分。將蒴果縱向切開，將種子播種于固體培養(yǎng)基(1/2 MS+蔗糖25 mg·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH值5.6)，置于溫度25 ℃，光照2 500 lx，12 h·d-1，濕度60%～80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

種子萌發(fā)情況用顯微鏡每周觀察1次，觀察結(jié)果參照Stewart等[12]的方法進行分級描述：0，種皮完整，未萌發(fā)；1，種胚膨大；2，種胚繼續(xù)膨大，種皮破裂(萌發(fā))；3，原球莖出現(xiàn)；4，長出第1片子葉；5，出現(xiàn)第2片子葉(幼苗)。

1.2.2 白芨種子萌發(fā)

以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖25 g·L-1，瓊脂粉6 g·L-1，pH值5.6，NAA(C)、6-BA(B)和土豆泥(A)的添加量采用正交設(shè)計L9(34)進行篩選。共9個處理，每個處理5次重復(fù)，置于溫度25 ℃，光照2 500 lx，12 h·d-1，濕度60%～80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察種子的萌發(fā)情況，30 d后統(tǒng)計種子的萌發(fā)率。具體1～3水平A分別為0、75、150 g·L-1，B分別為0.5、1.0、1.5 mg·L-1，C分別為0、0.1、0.2 g·L-1。培養(yǎng)基編號1～9處理依次為A1B1C1、A1B2C2、A1B3C3、A2B1C2、A2B2C3、A2B3C1、A3B1C3、A3B2C1、A3B3C2。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng)

當種子萌發(fā)形成的幼苗長到1.5 cm以上時，選擇長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)接到不同的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3株幼苗，培養(yǎng)條件同種子萌發(fā)，60 d后觀察白芨苗生根情況。壯苗生根培養(yǎng)基以1/2 MS+2 g·L-1活性炭為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的蔗糖(A)、NAA(B)、香蕉泥(C)和椰子汁(D)，pH 值5.8±0.2，進行正交L9(34)試驗。1～3水平A分別為10、20、30 g·L-1，B分別為0、0.5、1.0 mg·L-1，C分別為0、75、150 g·L-1，D分別為0、100、200 mL·L-1。具體培養(yǎng)基編號1～9處理依次為A1B1C1D1、A1B2C2D2、A1B3C3D3、A2B1C2D3、A2B2C3D1、A2B3C1D2、A3B1C3D2、A3B2C1D1、A3B3C2D3。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芨種子結(jié)構(gòu)與萌發(fā)過程

成熟的白芨蒴果呈圓柱形或鐮刀型，內(nèi)包含數(shù)萬粒微如塵埃(或面粉)的種子。白芨種子在成熟的過程中先形成種皮，再發(fā)育成胚。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，部分種子只有種皮沒有胚(圖1中A、B)。

A，種子的結(jié)構(gòu)；B，有胚種子和無胚種子；C，胚軸生長；D，種子種皮完整，未萌發(fā)；E，種胚膨大變綠；F，種胚繼續(xù)膨大，種皮破裂(萌發(fā))；G，原球莖的出現(xiàn)；H，長出第1片子葉；I，出現(xiàn)第2片子葉(幼苗)圖1 白芨種子的結(jié)構(gòu)與萌發(fā)過程(100×)

播種10 d左右，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，種子吸水膨脹，顏色由最初的淺褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，這些種子往往可以繼續(xù)萌發(fā)。部分種子無吸水膨脹現(xiàn)象或胚吸水膨脹后轉(zhuǎn)變成深褐色或黑色，這些種子后期不會萌發(fā)。播種20 d后，培養(yǎng)條件適宜的種子出現(xiàn)胚軸和葉原基(圖1中C)。

白芨種子的萌發(fā)和原球莖的發(fā)育可劃分為5個階段：0階段，白芨種子種皮完整，不開裂(圖1中D)；1階段，種胚膨大變綠(圖1中E)；2階段，種胚繼續(xù)膨大，種皮破裂(即萌發(fā))(圖1中F)；3階段，原球莖出現(xiàn)(圖1中G)；4階段，長出第1片子葉(圖1中H)；5階段，出現(xiàn)第2片子葉(即幼苗)(圖1中I)。

2.2 NAA、6-BA和土豆泥處理組合對白芨種子萌發(fā)的影響

播種30 d后觀察種子的萌發(fā)情況(圖2)，并統(tǒng)計比較白芨種子的萌發(fā)率(圖3)，數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基中種子的萌發(fā)有顯著性差異。其中，萌發(fā)率最高的7號培養(yǎng)基可達到(83.47±3.11)%，其次是2號培養(yǎng)基(76.23±8.32)%，萌發(fā)率最低的為8號培養(yǎng)基(50.27±4.85)%。1、2、4號培養(yǎng)基在7～8 d開始吸水膨脹，10 d左右種子由淺褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，15 d左右從中部突破種皮開始萌發(fā)。

圖2 9種培養(yǎng)基上白芨種子的萌發(fā)情況

圖3 9種培養(yǎng)基上白芨種子的萌發(fā)率

白芨種子萌發(fā)率極差分析顯示，激素NAA因素的極差最大(15.55百分點)，其次是6-BA(12.66百分點)，最小的為土豆泥(6.28百分點)。表明NAA含量對白芨種子萌發(fā)的影響最大，土豆泥、6-BA和NAA對種子萌發(fā)的影響程度為土豆泥<6-BA

2.3 NAA、蔗糖、香蕉泥與椰子汁處理組合對白芨組培苗壯苗生根培養(yǎng)的影響

不同濃度的植物激素和添加物對白芨組培苗的生長有較大影響(圖4)。當培養(yǎng)基中未添加NAA、香蕉泥和椰子汁時，白芨幼苗生長緩慢，植株矮小，產(chǎn)生的新根數(shù)量最少，而基本培養(yǎng)基中添加10 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1NAA、75 g·L-1香蕉泥和100 mL·L-1椰子汁組合時，白芨組培苗健壯，葉色濃綠，葉片明顯增加，根系粗壯(表1)。

圖4 9種培養(yǎng)基上白芨壯苗的生根情況

培養(yǎng)基編號生根率/%生根數(shù)/條鮮質(zhì)量/g生長情況11005.20.2992±0.1976e植株矮小,葉綠210011.41.2971±0.3871a植株健壯,葉綠,葉片增加,根系粗壯310010.20.6975±0.2416bc植株葉色黃綠,較健壯41006.20.4070±0.0922d植株葉色黃綠,根少且細長,長勢一般51009.60.7483±0.2094b植株葉色黃綠,長勢良好610010.71.0718±0.5947ab植株健壯,葉綠,長勢良好71006.80.4644±0.3299d植株葉色黃綠,長勢一般81007.10.7055±0.1975b植株葉色黃綠,長勢一般91007.30.6300±0.3230c植株葉色淺綠,長勢不均勻

白芨壯苗生根后鮮質(zhì)量的極差分析結(jié)果顯示，NAA含量因素的極差最大(0.526 8 g)，表明NAA對白芨組培苗鮮質(zhì)量的影響最大，各因素對鮮質(zhì)量的影響程度為：NAA>香蕉泥(0.387 8 g)>椰子汁(0.366 3 g)>蔗糖(0.164 6 g)。白芨生根數(shù)極差分析結(jié)果顯示，對白芨生根影響最大的因素也是NAA(3.33條)，各因素對白芨生根的影響程度為NAA>香蕉泥(2.80條)>椰子汁(2.33條)>蔗糖(1.86條)。NAA是影響白芨壯苗生根的主要因素，而蔗糖對壯苗生根的影響不大。總體來看，1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1+香蕉泥75 g·L-1+椰子汁100 mL·L-1+蔗糖10 g·L-1+活性炭2 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，pH 值5.8，有利于白芨的壯苗生根。

3 小結(jié)與討論

白芨的種子呈淺褐色紡錘形，由種皮和胚2部分組成。由于其不具胚乳，只有發(fā)育不完全的原胚，內(nèi)部儲存的少量營養(yǎng)物質(zhì)不能提供種子萌發(fā)所需的全部營養(yǎng)，因此，種子在野生狀態(tài)下需與真菌共生才能萌發(fā)[13]。白芨種子在成熟的過程中先形成種皮，再發(fā)育成胚，顯微觀察發(fā)現(xiàn)有很多種子只有種皮沒有胚，這可能是由于部分種子并沒有完全成熟。種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上生長10 d左右，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)種子吸水膨脹，顏色由最初的淺褐色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，這些種子往往可以繼續(xù)萌發(fā)，而部分種子無吸水膨脹現(xiàn)象或其胚吸水膨脹后轉(zhuǎn)變成深褐色或黑色，這些種子后期也不會萌發(fā)。這可能是種子沒有胚或培養(yǎng)條件不適宜等引起的。

目前，白芨大多以分株繁殖為主，但繁殖系數(shù)低，成本高，無法滿足市場的藥用需求，采用組培快繁的方式繁殖種苗是一個較好的選擇。本文主要探索了不同激素和添加物濃度組合對白芨種子萌發(fā)和壯苗生根的影響。前人研究發(fā)現(xiàn)，1/2 MS培養(yǎng)基是白芨種子萌發(fā)的最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基，激素和其他添加物在白芨種子萌發(fā)過程中也起著重要作用[14-16]。6-BA在較低濃度時，隨著濃度的增加，萌發(fā)率增加，但超過一定濃度時，萌發(fā)率反而下降[17]。NAA和土豆泥也可以促進白芨種子的萌發(fā)[18]。本研究以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、NAA和土豆泥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白芨種子在9種培養(yǎng)基上隨著時間的延長均能萌發(fā)，NAA對白芨種子萌發(fā)的影響最大，其次是6-BA，土豆泥的影響最小。最適合白芨種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+200 g·L-1土豆泥，萌發(fā)率可達83.47%±3.11%。

余朝秀等[7]研究發(fā)現(xiàn)，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，0.5 mg·L-1NAA是最佳生根濃度。吳華芬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，生根率可達100%的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1。本試驗結(jié)果表明，白芨壯苗生根培養(yǎng)中，各因素對鮮質(zhì)量和生根數(shù)的影響程度均為：NAA>香蕉泥>椰子汁>蔗糖，最適壯苗生根培養(yǎng)基是1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA+75 g·L-1香蕉泥+100 mg·L-1椰子汁+10 g·L-1蔗糖，這與袁寧[16]生根培養(yǎng)的結(jié)果一致。

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(責任編輯：侯春曉)

2017-06-01

江蘇省林業(yè)三新工程(LYSX[2015]02)；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)項目(2014KJ022，2017KJ31)

席剛俊(1981—)，男，湖北仙桃人，助理研究員，碩士，從事鐵皮石斛病害的研究工作，E-mail: 2469250487@qq.com。

韓正敏(1958—)，男，江蘇南京人，教授，博士，研究方向為森林微生物，E-mail: zmhan@njfu.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170828

S567.23+9

A

0528-9017(2017)08-1383-05

文獻著錄格式：席剛俊，李警保，韓正敏，等. 白芨種子萌發(fā)形態(tài)學(xué)觀察及組培快繁體系的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(8)：1383-1387.