烏腺金絲桃對佐劑性關節炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影響

朱潔宜，吳鑫宇，潘軍英，付新，李冀*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

烏腺金絲桃對佐劑性關節炎模型大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量的影響

朱潔宜1，吳鑫宇1，潘軍英2，付新1，李冀1*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討烏腺金絲桃治療類風濕關節炎的作用機制。方法：復制佐劑性關節炎(AA)大鼠模型，隨機分為空白組、模型組、烏腺金絲桃高劑量組、烏腺金絲桃低劑量組、雷公藤多苷片陽性對照組，采用酶聯免疫(ELISA)法檢測各組大鼠血清中細胞因子白介素17(IL-17)、前列腺素E2(PGE2)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、干擾素γ(IFN-γ)的含量。結果：烏腺金絲桃高劑量組和低劑量組AA大鼠血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量與模型組相比顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結論：烏腺金絲桃治療類風濕關節炎的作用機制可能與降低IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ含量有關。

烏腺金絲桃；佐劑性關節炎大鼠模型；類風濕關節炎;IL-17；PGE2；MMP-9；IFN-γ

類風濕關節炎(RA)是以侵蝕性、對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、全身性自身免疫性疾病[1-2]。目前發病機制不明，難治性、復發性、致殘性貫穿該病的始終。該疾病的基本病理表現為滑膜炎和血管翳的形成，后期常會出現關節軟骨和骨破壞，導致關節變形，使人致殘，該病無法治愈，所以對于控制病情的有效藥物研究一直在進行。中醫藥治療RA有著悠久的歷史，且中藥具有毒副作用小等優勢[3-4]。烏腺金絲桃為民間常用中草藥，味苦，性平，歸心、肝經，有鎮痛的功效，主治風濕關節痛。本研究復制佐劑性關節炎大鼠模型，觀察IL-17、PGE2、MMP-9及IFN-γ含量的變化,意在探討烏腺金絲桃治療RA的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SD雄性大鼠50只，體質量(200±20)g，由黑龍江中醫藥大學安全評價中心(GLP)提供;烏腺金絲桃(黑龍江中醫藥大學方劑學實驗室提供)；完全弗氏佐劑(Sigma公司)；雷公藤多苷片(上海復旦復華藥業有限公司，國藥準字Z31020415)；旋轉蒸發器(上海申勝生物技術有限公司)；低速離心機(科大創新股份有限公司中加分公司)；ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；i-control Infinite 200 Pro多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、烏腺金絲桃高劑量組(以下簡稱高劑量組)、烏腺金絲桃低劑量組(以下簡稱低劑量組)、雷公藤多苷片陽性對照組(以下簡稱陽性組)，每組10只。

1.2.2 模型制備

除空白組外，其余各組每只大鼠左后足拉直并于左后足跖皮下注射完全弗氏佐劑0.1 ml。

1.2.3 藥物制備

烏腺金絲桃全草剪碎，用16倍量蒸餾水浸泡60 min，冷凝回流提取藥液60 min并過濾，剩余藥渣用14倍量蒸餾水再次提取藥液40 min后濾出；剩余藥渣再以10倍量95%乙醇提取藥液30 min，再進行一次30 min醇提，濾出，將4次水醇提取的藥液混合，并用旋轉蒸發器濃縮至所需的濃度，放置冰箱4℃保存。

雷公藤多苷片研成粉末與蒸餾水充分混勻，制成濃度為0.1%的雷公藤多苷片混懸液，并加入0.01% 的懸混劑羧甲基纖維素鈉，放置冰箱4℃保存。

1.2.4 給藥方法

造模7日后開始灌胃給藥，每日1次，低劑量組灌服1.44 g/kg烏腺金絲桃提取液，高劑量組灌服5.76 g/kg烏腺金絲桃提取液[5-7]，陽性組灌服9.45 mg/kg雷公藤多苷片混懸液，空白組、模型組以1.0 ml/100 g灌服生理鹽水，每組均連續給藥21天。

1.3 血清中IL-17、PGE2、MMP-9、IFN-γ的含量測定

末次給藥后24 h內大鼠禁食禁水，之后全部大鼠稱重，腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠(5 mlkg)，經頸總動脈取血，將血置于采血管中，3 000 rmp離心15 min，取上清，保存于-20℃冰箱，采用ELISA法檢測。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠血清中IL-17、PGE2的含量比較

由表1可知，模型組大鼠血清IL-17、PGE2的含量明顯升高，與空白組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。而高、低劑量組和陽性組大鼠血清中IL-17、PGE2的含量均有所下降，與模型組比較，差異具差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

表1 各組大鼠血清IL-17、PGE2的含量比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量比較

由表2可知，模型組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量明顯升高，與空白組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)；低劑量組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量與模型組相比差異顯著(P<0.05)，而高劑量組、陽性組大鼠血清中MMP-9、IFN-γ的含量與模型組比較，具有極顯著性差異(P<0.01)。

表2 各組大鼠血清MMP-9、IFN-γ的含量比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

RA的發病機制尚未完全明確，但相關研究表明其發病機制與一些細胞因子密切相關。

IL-17主要由Th17細胞分泌，其參與RA的炎癥反應和進行性損壞可通過多種途徑實現[8]。IL-17常通過與其他細胞因子的相互作用來促進炎癥反應，從而介導炎癥細胞浸潤關節以致組織損傷[9]。還有研究表明,IL-17能促進滑膜血管的增生，加重關節破壞，這是通過誘導滑膜細胞產生金屬蛋白酶實現的[10]。本研究顯示,烏腺金絲桃可下調IL-17的含量，說明對抑制RA的炎癥和骨破壞有一定的作用，也通過這一機制證明了其治療RA的可能性。

花生四烯酸經環氧化酶代謝產生前列腺素，而前列腺素的合成與釋放體現在炎癥反應的全過程中。組織損傷和多種關節炎性疾病的產生與PGE2介導蛋白水解酶和炎性因子的產生是息息相關的[11]，而RA的炎性滲出與PGE2改變血管通透性亦有關[12]。阻斷PGE2的產生可以治療RA，非甾體抗炎藥就是通過此途徑來發揮藥效的。本實驗結果發現，烏腺金絲桃可降低PGE2的含量，說明PGE2可能是烏腺金絲桃治療的RA機制之一。

MMP-9是MMPs家族的成員，屬明膠酶類，有研究表明干擾素α可促進單核巨噬細胞MMP-9的合成，加強炎性細胞的侵襲力，造成RA骨和軟骨的破壞[13]，而血清MMP-9也可作為暫無骨破壞RA患者的早期預測指標[14]，亦有研究發現血管翳的形成與MMP-9促使滑膜下層血管生成有關[15]。本實驗研究發現，烏腺金絲桃高、低劑量組可明顯降低模型大鼠血清中MMP-9的含量，證明其可能通過MMP-9這一機制參與了RA的治療。

IFN-γ是有著廣泛免疫調節作用的干擾素，與關節炎的發病密切相關[16]，可刺激并增強RA的炎癥反應，參與關節軟骨等組織的損傷，且作為免疫刺激因子可以促使CD4+Th細胞向Th1細胞的極化，促使免疫系統活化[17]。還有動物實驗表明，下調血清及滑膜中IFN-γ的表達，利于平衡Th1/Th2細胞，從而抑制滑膜局部細胞及體液免疫反應,減輕關節滑膜炎和血管病變[18]。本實驗結果表明，烏腺金絲桃高、低劑量組可明顯下調模型大鼠血清中IFN-γ的含量，說明IFN-γ可能是烏腺金絲桃治療RA的作用機制之一，這為烏腺金絲桃治療RA的下一步深入研究提供了平臺。

烏腺金絲桃，又名穩心草、趕山鞭，味苦，性平，歸心、肝經，有止血、鎮痛、通乳的功效，主治咯血、吐血、子宮出血，風濕關節痛，跌打損傷，神經痛，乳腺炎，乳汁缺乏，外用時常用來治療疔瘡腫毒和外創出血。之前對于烏腺金絲桃的研究多集中在化學成分、治療心臟病、抗抑郁等方面[19-20]，本研究從新的角度出發，分析其治療RA的可能性。而從本實驗結果來看，烏腺金絲桃可從抗炎、調節免疫、抑制骨破壞等方面發揮其治療RA的功效[21]，這不僅為接下來的深入研究提供了基礎，更為臨床治療RA的用藥提供了新思路。

[1] 葛均波,徐永健.內科學[M].8版.北京:人民衛生出版社,2013:808.

[2] 朱潔宜,吳鑫宇,周海純,等.中醫藥治療類風濕關節炎的研究進展[J].中醫藥信息,2015,32(1):115-117.

[3] 孫焱,于慧敏.姜黃素治療類風濕關節炎作用機制研究進展[J].中醫藥學報,2015,43(6):113-116.

[4] 于天一,程偉.淺論傳統中醫學在現代臨床治療體系中的作用及其影響——以痹證(類風濕關節炎)治療手段為例[J].中醫藥學報,2015,43(5):4-7.

[5] 李冀,吳全娥,高彥宇,等.烏腺金絲桃對抑郁癥大鼠海馬單胺類神經遞質含量5-HT及5-HIAA的影響[J].中醫藥信息,2012,29(5):18-20.

[6] 葉綠萍,黃志儉,劉小意,等.趕山鞭水提取物及醇提取物毒性及抗炎鎮痛作用[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(17):204-205.

[7] 黑龍江省呼盟地方病防治研究所.穩心草對慢型克山病初步治療觀察[J].黑龍江醫藥,1976,(z1):46-48.

[8] Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J].J Exp Med,2005,201(2):233-240.

[9] 錢雷,呂麗君,徐敏,等.活化的類風濕關節炎患者外周血單個核細胞Toll 樣受體4誘導Th17細胞分化[J].中華風濕病學雜志,2011,15(12):816-820.

[10] Zhu J,Paul WE.CD4 T cell:fates,function,and faults[J].Blood,2008,112(5):1557-1569.

[11] Kojima F,Kato S,Kawai S.Prostaglandin E synthase in the pathophysiology of arthritis[J].Fundam Clin Pharmacol,2005,19(3):255-261.

[12] 莫書蓉,孟憲麗.舒筋活絡膠囊對佐劑關節炎大鼠的作用及部分機理研究[J].中藥藥理與臨床,2008,24(2):68-70.

[13] 謝建民,王好問,陸才生.TNF-α上調單核巨噬細胞MMP-9的活性與類風濕關節炎關節破壞的關系[J].中國病理生理雜志,2009,25(6):1181-1185.

[14] 吳振彪,盧寧,王彥宏,等.基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9與類風濕性關節炎關節破壞的關系[J].中國免疫學雜志,2006,22(3):260-262.

[15] Jackson C,Nguyen M,Arkel J,et al.Selective matrix metalloproteinase(MMP)inhibition in rheumatoid arthritis-targetting gelatinase A activation[J].Inflamm Res,2001,50(4):183-186.

[16] Simon A,Seipe1 T,Sieper J.Divergent T cell cytokine patterns in inf1ammatory arthritis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:292.

[17] Palmer G,Mezin F,Juge-Aubry CE,et al.Interferon beta stimulates interleukin 1 receptor antagonist production in human articular chondrocytesand synovial fibroblasts[J].Ann Rheum Dis,2004,63(1):43-49.

[18] 曹煒,姜泉,吳振宇,等.風濕清對Ⅱ型膠原誘發類風濕關節炎大鼠白細胞介素-4、γ-干擾素及趨化因子的影響[J].中國中西醫結合雜志,2009,29(12):1114-1116.

[19] 馬育軒,王艷麗,周海純,等.烏腺金絲桃的化學成分及藥理作用研究進展[J].中醫藥學報,2012,40(6):125-126.

[20] 李冀,閆東,潘若凡,等.烏腺金絲桃抗快速型心律失常活性成分作用機制研究[J].中醫藥學報,2013,41(1):9-10.

[21] 吳鑫宇,高彥宇,朱潔宜,等.烏腺金絲桃對類風濕關節炎大鼠NO及VEGF表達的影響[J].中醫藥信息,2016,33(4):4-6.

EffectofHypericumAttenuatumChoisyonSerumLevelsofIL-17,PGE2,MMP-9andIFN-γinAdjuvantArthritisRats

ZHUJie-yi1，WUXin-yu1，PANJun-ying2,FUXin1,LIJi1*

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective:To investigate the mechanism of Hypericum Attenuatum Choisy(HAC) in the treatment of rheumatoid arthritis. Methods:The rats were randomly divided into the blank group, the model group, the high-dose HAC group, the low-dose HAC group, and the Tripterygium glycosides group. Adjuvant arthritis(AA) model was established in the other four groups except the blank group. The contents of interleukin 17(IL-17), prostaglandin E2(PGE2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) and interferon γ (IFN- γ) in serum were tested by ELISA method. Results: The contents of IL-17, PGE2, MMP-9, and IFN- γ in the high-dose HAC group and the low-dose HAC group were significantly decreased compared to those in the model group(P<0.05 orP<0.01). Conclusion:The mechanism of HAC in the treatment of rheumatoid arthritis may be related to modulating IL-17, PGE2, MMP-9, IFN-γ.

Hypericum Attenuatum Chosiy; Adjuvant arthritis model rats; Rheumatoid arthritis;IL-17;PGE2;MMP-9;IFN-γ

國家自然科學基金項目(No.81373536);黑龍江中醫藥大學科研基金面上項目(No.201722)

朱潔宜(1988-)，女，黑龍江中醫藥大學2015級中醫內科學專業博士研究生。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生導師，主要研究方向:方劑配伍規律及作用機理研究。

2016-12-16

修回日期：2016-12-30

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0013-03