維格列汀原料藥有關物質測定方法的研究

黃艷　楊雪峰　陳雪云

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定維格列汀原料藥的有關物質。 方法 采用Waters XTerra MS C18柱（4.6mm×50mm，3.5μm），以磷酸鹽緩沖液-水-乙腈-甲醇（80：120：3：3）為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（8：9：3）為流動相B，梯度洗脫，檢測波長為210nm；流速1.5mL/min。 結果 維格列汀與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間的分離度均大于1.3，檢測限為1.2～1.6ng，定量限為2.4～3.3ng。 結論 該方法適用于維格列汀關物質的測定。

[關鍵詞] 高效液相色譜法；維格列汀；有關物質；測定

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）15-42-04

[Abstract] Objective To establish an HPLC method to determine the related substance in Vildagliptin. Methods The column was Waters XTerra MS C18 （4.6mm×50mm，3.5μm），the mobile phase A was treated with phosphate buffer-water-acetonitrile-methanol（80：120：3：3），the mobile phase B was treated with phosphate buffer-water-acetonitrile-methanol（8：9：3），which was used as gradient elution.The detection wavelength was 210nm，the flow rate was 1.5mL/min. Results The resolution of vildagliptin and its related substance was above 1.3，detection limit was 1.2～1.6ng， quantification limit was 2.4～3.3ng. Conclusion The method was suitable for the determination of related substance in vildagliptin.

[Key words] HPLC；Vildagliptin；Related substance；Determination

維格列汀（Vildagliptin）是一種口服給藥的Ⅳ型二肽基肽酶（DPP-4）抑制劑，通過與DPP-4 結合形成DPP-4復合物而抑制該酶的活性，在提高胰高血糖素樣多肽（GLP）-1 濃度、促使胰島B細胞產生胰島素的同時，可降低胰高血糖素濃度，從而降低血糖，且對體重無明顯影響[1-7]。根據維格列汀的合成工藝[8-12]，可能存在的有關物質有維格列汀雙取代雜質、維格列汀酰胺、維格列汀環脒、維格列汀二酮哌嗪等。為了保證藥品的安全性，現對自制的維格列汀原料藥有關物質測定方法進行研究，建立了高效液相色譜法（HPLC）不加校正因子的主成分自身對照法對進行維格列汀雙取代雜質限量檢查；采用加校正因子的主成分自身對照法測定維格列汀環脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪，方法簡便、靈敏度高、專屬性強、準確度高。

1 儀器與試藥

島津LC-2010A HT液相色譜儀，甲醇、乙腈均為色譜純，無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀、鹽酸

均為分析純，雙蒸水；維格列汀（自制，批號為20141101、20141102、20141201），維格列汀對照品（TLC，批號為1376-008A1），中間體1、中間體2（自制），維格列汀雙取代雜質對照品（TLC，批號為1497-003A7），維格列汀酰胺對照品（TLC，批號為1448-001A2），維格列汀環脒（TLC，批號為1466-010A3），維格列汀二酮哌嗪（TLC，批號為1424-093A3）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[13-14]與系統適用性試驗

色譜柱為Waters XTerra MS C18柱（4.6mm× 50mm，3.5μm），以磷酸鹽緩沖液-水-乙腈-甲醇（80：120：3：3）為流動相A，以磷酸鹽緩沖液-乙腈-甲醇（8：9：3）為流動相B，梯度洗脫（0～1.0min，100%A；1.0～3.0min，100%A→90%A；3.0～8.0min，90%A→30%A；8.0～8.1min，30%A→100%A；8.1～11.0min，100%A）；檢測波長為210nm；柱溫35℃；流速1.5mL/min。分別取維格列汀、中間體1、中間體2、維格列汀雙取代雜質、維格列汀酰胺、維格列汀環脒和維格列汀二酮哌嗪對照品各適量，加溶劑[鹽酸溶液（2→1000）-乙腈（90：10）]溶解制成每1mL中約含維格列汀1mg，中間體1、中間體2、維格列汀雙取代雜質、維格列汀酰胺、維格列汀環脒和維格列汀二酮哌嗪各10μg的溶液，搖勻。精密量取10?L，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。理論塔板數按維格列汀主峰計算為16645，各相鄰峰之間的分離度均>1.3。

2.2 1%對照溶液進樣精密度試驗

精密稱取供試品適量，加溶劑溶解并稀釋制成約含維格列汀10?g/mL的溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，連續進樣6次測定，結果色譜峰面積的RSD為0.27%。表明方法的進樣精密度良好。

2.3 專屬性試驗

精密量取供試品約0.2g，置100mL棕色量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得供試品母液。精密量取供試品母液5mL，共5份，分別置10mL量瓶中，按以下條件試驗：一份加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；一份加0.3%的過氧化氫溶液1mL，搖勻，室溫放置60min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；一份加1mol/L鹽酸溶液1mL，搖勻，室溫放置3小時，用1mol/L氫氧化鈉溶液1mL中和，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；一份加1mol/L氫氧化鈉溶液1mL，搖勻，室溫放置1.5h，用1mol/L鹽酸溶液1mL中和，加溶劑至刻度，搖勻，濾過；一份置100℃水浴2.7h，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過；取本品適量，在光照強度為4500lx±500lx的培養箱照射5d，精密稱取適量，加溶劑溶解并稀釋制成含維格列汀1mg/mL的溶液，搖勻，濾過。分別精密量取上述6種溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。

2.4 檢測限和定量限

分別精密稱取維格列汀、維格列汀酰胺、維格列汀環脒、維格列汀二酮哌嗪和維格列汀雙取代雜質對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋制成每1mL中約含維格列汀、維格列汀酰胺、維格列汀環脒、維格列汀二酮哌嗪和維格列汀雙取代雜質10μg/mL的溶液，搖勻，再逐級稀釋，精密量取10?L注入液相色譜儀，經分析，維格列汀的檢測限為1.6ng（S/N≈3）、定量限為3.3ng（S/N≈10），維格列汀酰胺的檢測限為1.4ng（S/N≈3）、定量限為2.8ng（S/N≈10），維格列汀環脒的檢測限為1.2ng（S/N≈3）、定量限為2.4 ng（S/N≈10），維格列汀二酮哌嗪的檢測限為1.6ng（S/N≈3）、定量限為3.3ng（S/N≈10），維格列汀雙取代雜質的檢測限為1.5ng（S/N≈3）、定量限為3.1ng（S/N≈10）。

2.5 線性關系試驗及校正因子的測定

分別精密稱取維格列汀、維格列汀環脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪及維格列汀雙取代雜質對照品適量，分別加溶劑溶解并稀釋成每1mL中約含各組分10μg的溶液，分別精密量取該溶液0.25、0.4、0.5、0.6、0.75mL置5mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（μg/mL）對峰面積繪制標準曲線，線性回歸方程、校正因子等結果見表1。

2.6 回收率試驗

精密稱取維格列汀供試品和維格列汀環脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪及維格列汀雙取代雜質對照品，加溶劑溶解并制成供試品中含有各雜質濃度為限度的50%、100%及150%溶液各三份，分別取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖并計算各雜質的回收率及RSD。維格列汀環脒回收率為102.99%，RSD=0.88%（n=9）；維格列汀酰胺回收率為102.76%，RSD=1.34%（n=9）；維格列汀二酮哌嗪回收率為100.68%，RSD=1.20%（n=9）；維格列汀雙取代雜質回收率為99.95%，RSD=1.38%（n=9）。有關物質雜質回收率試驗中各雜質平均回收率均在98%～102%，各雜質回收率RSD均在2%以下，說明方法準確度良好。

2.7 重復性和溶液穩定性試驗

取批號為20141101的維格列汀6份，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制每1mL中約含維格列汀1mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。分別取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各已知雜質按峰面積乘以校正因子計算，未知雜質按不加校正因子的主成分自身對照法計算，結果維格列汀環脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪均未檢出，維格列汀雙取代雜質RSD=1.44%，未知雜質RSD=0.00%，總雜質RSD=0.81%），表明方法重復性良好。取其中一份溶液，分別放置0h、1h、2h、4h、8h、10h后測定，結果各雜質峰峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液10 h內穩定性良好。

2.8 供試品有關物質檢查

取3批供試品，照2.7項下的方法制備供試品溶液及對照溶液，照2.1項下的色譜條件，分別取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各已知雜質按峰面積乘以校正因子計算，未知雜質按不加校正因子的主成分自身對照法計算，見表2。

3 討論

檢測波長的選擇：分別精密稱取維格列汀及各雜質對照品適量，加溶劑溶解并稀釋制成每1ml中約含20μg的溶液，照紫外-可見分光光度法，于190～400nm波長范圍內掃描，各組分在210nm有均吸收。因此，將本品有關物質的檢測波長確定為210nm。

維格列汀為弱堿性物質，若流動相為酸性或中性溶液，其在C18柱上不易洗脫或色譜峰嚴重拖尾。本文采用pH值為（6.50±0.05）的磷酸鹽緩沖液[取無水磷酸二氫鉀1.3g，置1000mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用磷酸氫二鉀溶液（取無水磷酸氫二鉀1.5g，加水10mL使溶解）調節pH值至6.50±0.05]配制流動相，使藥物以陽離子的形式存在，可以降低藥物的保留值、改善拖尾。

專屬性試驗結果表明，維格列汀在高溫和強堿破壞中產生維格列汀酰胺，在氧化和高溫中產生維格列汀二酮哌嗪，在高溫中產生維格列汀環脒，維格列汀雙取代雜質在強光、強酸、強堿、氧化及高溫條件下均無明顯變化。通過安捷倫色譜工作站提供的“全波長法”分析以上色譜圖，維格列汀峰純度指數值均大于0.990，說明主峰均為單一物質峰，且降解產物峰、已知雜質峰均與主峰的分離度滿足檢測要求，說明本法專屬性良好。

校正因子的測定表明，維格列汀雙取代雜質的校正因子沒有超出0.9～1.1的范圍，可直接采用不加校正因子的主成分自身對照法進行限量檢查；維格列汀環脒、維格列汀酰胺、維格列汀二酮哌嗪的校正因子超出0.9～1.1的范圍，應采用加校正因子的主成分自身對照法測定[15-16]，此法無需長期提供雜質對照品，同時又考慮到了雜質與主成分的響應值不同所引起的誤差，準確度較好。

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（收稿日期：2017-06-12）