FOXO4在非小細胞肺癌中的表達及意義

徐明明，李建超，劉益飛，劉俊華

1.南通大學附屬醫院心胸外科，江蘇南通 226000；2.鹽城市第一人民醫院急診科，江蘇鹽城 224006；3.南通大學附屬醫院心胸外科病理科，江蘇南通 226000

FOXO4在非小細胞肺癌中的表達及意義

徐明明1，李建超2，劉益飛3，劉俊華1

1.南通大學附屬醫院心胸外科，江蘇南通 226000；2.鹽城市第一人民醫院急診科，江蘇鹽城 224006；3.南通大學附屬醫院心胸外科病理科，江蘇南通 226000

目的 探討FOXO4在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達及其臨床意義。 方法 方便選取南通大學附屬醫院心胸外科2005年3月—2007年3月手術切除的150例NSCLC標本及20例正常肺組織標本，應用SP法分別檢測FOXO4表達情況，并分析NSCLC組織中FOXO4表達與臨床病理特征之間的關系。結果FOXO4在腫瘤組織中陽性表達率為42.67%，明顯低于正常肺組織的80.00%（P＜0.01）。FOXO4在腫瘤組織中的表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小和病理分型之間差異無統計學意義（P>0.05）；但與分化程度、淋巴結轉移和TNM分期之間密切相關（P＜0.05）。其中高、中分化組FOXO4陽性表達率(62.50%;50.00%)明顯高于低分化組(25.00%)（P=0.004）；無淋巴結轉移組表達率(80.00%)明顯高于淋巴結轉移組(29.09%)（P＜0.01）；TNMⅢ期組表達率(7.32%)明顯低于Ⅰ、Ⅱ期組(77.50%;43.48%)（P＜0.01）結論FOXO4在NSCLC中低表達，提示其可能為抑癌基因。

FOXO4；非小細胞肺癌；免疫組織化學

隨著環境污染的加重，肺癌的發病率及死亡率呈急劇上升趨勢。肺癌的5年生存率低于乳腺癌和大腸癌，僅為15%。FOXO轉錄因子是叉頭框（Forkhead box,FOX）家族中的一員，通過調節靶基因的轉錄，參與調控細胞周期、凋亡、分化等過程[1]。FOXO4是FOXO亞家族中的成員，在胃癌、大腸癌中的表達都有所下調或缺失，表明多種機制導致的FOXO4失活可能促進了腫瘤的發生發展[2-3]。該研究應用免疫組化法檢測FOXO4在NSCLC中的表達情況，并分析其與臨床病理特征之間的關系，試圖闡明FOXO4在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）發生發展中的作用機制。方便收集南通大學附屬醫院心胸外科2005年3月—2007年3月手術切除NSCLC標本150例，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

NSCLC標本150例，其中男122例，女28例；中位年齡64歲；鱗癌97例，腺癌41例，腺鱗癌12例；腫瘤≤3 cm 45例，＞3 cm 105例；高分化16例，中分化82例，低分化52例；淋巴結轉移110例，無轉移40例；Ⅰ期40例、Ⅱ期69例，Ⅲ期41例。正常肺組織20例，取自癌灶遠處，診斷無癌細胞浸潤。所有標本制備成組織微陣列（TMA）。

1.2 方法

1.2.1 TMA制作 TMA是選取有代表性的組織部分，順序排列在載體上而制備成微縮組織陣列。在蠟塊中標記代表性部位；石蠟與蜂蠟混合，制備成空白蠟塊，芯片儀蠟塊上打孔；將供體蠟塊軟化，細針鉗取代表性組織轉移至空白打孔蠟塊上；制備成組織芯片。

1.2.2 FOXO4蛋白檢測 采用免疫組化 SP法檢測FOXO4蛋白表達。切片脫蠟、脫水；熱修復抗原；消除內源性過氧化物酶活性；正常羊血清封閉；滴加兔抗人單克隆抗體FOXO4；滴加二抗；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素；DAB顯色；蘇木素復染；鹽酸酒精分化；PBS液返藍；梯度酒精脫水；二甲苯浸泡透明；封片；已知標本作陽性對照，PBS液代替一抗作陰性對照。

1.2.3 結果判定 采用雙盲法對結果進行評估。FOXO4蛋白表達主要位于細胞核，陽性染色呈棕黃色或棕褐色；高倍鏡下每張切片選取5個視野，每視野計數100個腫瘤細胞。FOXO4蛋白根據染色強度和陽性細胞百分比進行評分，染色強度分數標準：細胞無著色0分、淡棕色1分、棕色2分、棕褐色3分；同物鏡下計數陽性細胞數：0分，陽性細胞數比率﹤1%；1分，比率2%～25%；2分，比率26%～50%；3分，比率51%～75%；4分，比率﹥75%。兩項得分相乘：0～3分為 “-”；4～6分為“+”；7～9分為“++”；10～12分為“+++”。“+～+++”。

1.3 統計分析

運用SPSS 17.0統計學軟件分析，計數資料采用χ2檢驗，用[n（%）]表示，P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FOXO4在NSCLC和正常肺組織中的表達

FOXO4蛋白表達主要位于細胞核，陽性染色呈棕褐色或棕黃色。150例NSCLC組織中，FOXO4蛋白陽性率42.67%，明顯低于正常對照組（80.00%）(P＜0.01)。圖1A、圖1B、圖1C分別可見正常肺細胞、鱗癌細胞及腺癌細胞的細胞核內棕褐色顆粒沉積。

圖1A 正常肺組織FOXO4染色陽性（SP×40/400）

圖1B 鱗癌組織FOXO4染色陽性（SP×40/400）

圖1C 腺癌組織FOXO4染色陽性（SP×40/400）

2.2 FOXO4表達與NSCLC臨床病理特征的關系

FOXO4在NSCLC中的表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小和腫瘤類型之間無明顯相關性（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關（P﹤0.05），見表1。

3 討論

肺癌的發生發展由癌基因、抑癌基因及其它因子共同參與。通過研究轉錄因子FOXO4，以期有助于闡明FOXO4在NSCLC發生發展過程中的作用機制。FOXO4是FOXO亞家族中的成員之一，FOXO4的DNA結合域具有特征性結構：3個α螺旋、3個β鏈及2個翅膀狀大環[4]。FOXO4存在于人體組織器官中，其中心臟、骨骼肌中呈高水平表達。此外，FOXO4還與多種腫瘤的發生發展密切相關，如乳腺癌、大腸癌、胃癌。

磷酸化是FOXO4蛋白最重要的翻譯后修飾。在胰島素生長存活因子刺激下，PI3K-PKB/SGK信號通路激活，PKB和SGK進入細胞核后對FOXO4蛋白產生磷酸化，其位點為 Thr32、Ser197、Ser262，導致磷酸化的FOXO4蛋白出核并滯留于細胞質，進而抑制靶基因的轉錄。14-3-3特異性結合磷酸化的FOXO4，通過干擾核定位序列以及誘導FOXO4構象改變，使其暴露出核輸出序列并與核外運蛋白作用，促進FOXO4蛋白出核失活[5]。轉錄因子FOXO4除接受磷酸化、乙酰化修飾外，O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化和單泛素化也是其重要的修飾方式，并且在生命活動中起重要作用[6]。

表1 FOXO4表達與臨床病理特征的關系

機體細胞中，FOXO4蛋白受PI3K/AKT、Ras調控，調節p27kip1和cyclin D的表達，使細胞周期分別停滯于G1、S期，進而抑制細胞增殖。缺氧誘導因子HIF-1α表達增加誘導血管生成、糖代謝、紅細胞生成等相關基因的表達，而這些是腫瘤增大必需的條件。研究發現，定位于核內的FOXO4通過下調HIF-1α蛋白水平，抑制血管內皮生長因子、葡萄糖載體1和紅細胞生成素的表達，從而抑制腫瘤的生長[7]。miR-421在鼻咽癌細胞中通過抑制FOXO4轉錄活性，使其下游分子如p21、 p27、Bim及Fasl的表達下降，進而促進腫瘤細胞增殖和抵抗細胞凋亡。已知作為抑癌基因的FOXO4，不僅參與阻滯腫瘤細胞周期，還通過多種途徑參與細胞凋亡過程。FOXO4通過激活Bim因子，上調Bim蛋白表達水平，從而促進腫瘤細胞凋亡[8]。在非應激條件下的人上皮癌細胞中，siRNA沉默 NAD依賴的脫乙酰酶SIRT1后，FOXO4介導了下游caspase3和caspase7的腫瘤細胞凋亡，而此過程與P53、FOXO3a無關。Lee發現，表皮生長因子介導了FOXO4蛋白磷酸化，使ANXA8表達下降，進而誘導了腫瘤細胞EMT發生，提示FOXO4可能參與腫瘤轉移過程[9]。該文發現FOXO4蛋白表達無淋巴結轉移組顯著高于有淋巴結轉移組（80.00%vs 29.09%）(P<0.01)，提示FOXO4參與抑制腫瘤轉移。劉向強等[2]發現FOXO4在大腸癌組織中的陽性表達率明顯低于癌旁組織 （47.50%vs 91.25%，P< 0.001），提示FOXO4在大腸癌發生發展過程中扮演著抑制因子的作用。該研究采用 SP法檢測了 150例NSCLC標本中FOXO4蛋白的表達情況，發現FOXO4蛋白主要分布于細胞核，其表達率明顯低于正常肺組織（80.00%vs 42.67%），兩組比較差異有統計學意義。

分析NSCLC組織中FOXO4表達與臨床病理特征之間的關系，發現FOXO4表達缺失與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移密切相關，提示FOXO4在NSCLC發生、分化及轉移過程中起著抑制作用。因此，該研究認為FOXO4的低表達與NSCLC發生發展密切相關，FOXO4可能為抑癌基因。

[1]Wilk A,Urbanska K,Grabacka M,et al.Fenofibrate-Induced Nuclear Translocation of FoxO3A Triggers Bim-Mediated Apoptosis in Glioblastoma Cells in Vitro[J].Cell Cycle,2012,11(14):2660-2671.

[2]劉向強,湯善宏,張志勇,等.轉錄因子FOXO4在大腸癌中的表達及意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2011,27(9): 969-971.

[3]張超,王德榮,曲飛,等.轉錄因子FOXO4與胃癌及Hp感染關系的臨床研究[J].中國現代普通外科進展,2013,16 (3):210-213.

[4]Vacha P,Zuskova I,Bumba L,et al.Detailed Kinetic Analysis of the Interaction Between the FOXO4-DNA-Binding Domain and DNA.[J].Biophysical Chemistry,2013,184(3): 68-78.

[5]Obsil T,Ghirlando R,Anderson DE,et al.Two 14-3-3 Binding Motifs are Required for Stable Association of Forkhead Transcription Factor FOXO4 with 14-3-3 Proteins and Inhibition of DNA Binding[J].Biochemistry,2014,42(51): 15264-15272.

[6]Ho SR,Wang K,Whisenhunt TR,et al.O-GlcNAcylation Enhances FOXO4 Transcriptional Regulation in Response to Stress[J].Febs Letters,2010,584(1):49-54.

[7]Fu B,Li Y,Zhao Z.The Correlation of HIF-1α,MACC1 and FOXO4 in Gastric Carcinoma Pathology and Prognosis[J]. Chongqing Medicine,2015(9):1180-1183.

[8]Wang W,Zhou PH,Hu W.Overexpression of FOXO4 Induces Apoptosis of Clear-Cell Renal Carcinoma Cells through Downregulation of Bim[J].Molecular Medicine Reports,2016,13(3):2229.

[9]Lee MJ,Yu GR,Yoo HJ,et al.ANXA8 Down-Regulation by EGF-FOXO4 Signaling is Involved in Cell Scattering and Tumor Metastasis of Cholangiocarcinoma.[J].Gastroenterology,2009,137(3):1138.

Expression and Significance of FOXO4 in the Non-small-cell Lung Cancer

XU Ming-ming1,LI Jian-chao2,LIU Yi-fei3,LIU Jun-hua1

1.Department of Cardio-Thoracic Surgery,Hospital Affiliated to Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226000 China；2.Department of Emergency,Yancheng First People’s Hospital,Yancheng,Jiangsu Province,224006 China；3.Department of Cardio-Thoracic Surgery&Department of Pathology,Hospital Affiliated to Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226000 China

ObjectiveTo study the expression and significance of FOXO4 in the non-small-cell lung cancer.MethodsConvenient selection 150 cases of NSCLC specimens and 20 cases of normal lung tissue specimens with operation resection in our hospital from March 2005 to March 2007 were selected and the FOXO4 expression was tested by the SP method and the correlation between the FOXO4 expression in NSCLC tissues and clinical pathological features was analyzed.ResultsThe positive expression rate of FOXO4 in the normal tissues was obviously lower than that in the normal lung tissue, (42.67%vs 80.00%)(P<0.01),and the difference in the expression of FOXO4 in tumor tissues among different genders, ages,smoking,mass sizes and pathological types was not statistically significant(P>0.05),but the expression was closely related to the differentiation degree,lymphatic metastasis and TNM staging(P<0.05),and the positive expression rate of FOXO4 in the high and moderate differentiation groups was obviously higher than that in the low differentiation group(62.50%, 50.00%vs 25.00%),（P=0.004）.and the expression rate in the no lymphatic metastasis group was obviously higher than that in the lymphatic metastasis group,(80.00%vs 29.09%)(P<0.01),and the expression rate in the TNMⅢgroup was obviously lower than that in the TNMⅠ and TNMⅡ groups(7.32%vs 77.50%,43.48%)(P<0.01).ConclusionThe expression of FOXO4 in NSCLC is low,which reminds that it may be the cancer suppressor gene.

FOXO4;Non-small-cell lung cancer;Immunohistochemistry

R734

A

1674-0742（2017）06（c）－0031-04

10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.18.031

2017-03-22）

徐明明（1988-），男，江蘇南通人，碩士，住院醫師，研究方向：胸部腫瘤診治。