組織工程修復軟骨缺損的研究進展

張治金++曾林如++朱芳兵++郭林

[摘要] 關節軟骨缺損所帶來的疼痛及關節活動障礙嚴重影響了患者的生活質量，組織工程技術應用于軟骨缺損的修復成為研究的熱點，為其治療提供了新的思路。本文就種子細胞的要求、來源以及培養方法，生物支架的要求及類型，細胞生長調節因子進行綜述，總結組織工程修復軟骨缺損的研究進展。

[關鍵詞] 軟骨缺損；組織工程；種子細胞；支架；細胞因子

[中圖分類號] R681.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（b）-0036-05

Study progress of tissue-engineered cartilage in repairing cartilage defect

ZHANG Zhijin1 ZENG Linru2 ZHU Fangbing3 GUO Lin4

1.Eleven Ward Two Department of Hand Surgery， Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China； 2.Department of Ankle Surgery， Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China； 3.Department of Sports Medicine， Xiaoshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City， Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China； 4.Department of Joint Surgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116001， China

[Abstract] The pain and joint movement disorder caused by articular cartilage defects have seriously affected the quality of life of patients. The application of tissue engineering technology in the repair of cartilage defects has become a hot topic in research， which provides a new idea for its treatment. In this paper， we review the research progress of tissue engineering to repair cartilage defects on the basis of the requirements， sources and methods of seed cells， the requirements and types of biological scaffold， and the regulation of cell growth factors.

[Key words] Cartilage defect； Tissue engineering； Seeding cells； Support； Cytokines

關節軟骨缺損為常見的骨關節病之一，臨床上主要表現為頑固性疼痛、關節活動障礙，甚者可喪失關節功能，是引起肢體功能喪失和降低生活質量的主要原因之一。國外有學者統計關節軟骨損傷的發病率可達5%，從事特殊職業發生率可達22%～50%[1-2]。軟骨在關節活動中占據重要的作用[3]，但其自身修復能力非常有限。研究表明，直徑< 3 mm的軟骨缺損有可能部分或全部修復，直徑> 4 mm則不能自行修復[4]。傳統的軟骨修復術雖然能在一定程度上緩解癥狀，但仍存在缺陷，研究發現修復后的組織在組成、結構和力學特性上與正常軟骨存在明顯的區別[5]。組織工程學致力于發展新生代材料用以修復、替代、提高人體器官和功能[6]。組織工程技術的興起無疑為軟骨缺損的修復提供新的思路，其重點在于種子細胞、可降解的支架材料以及細胞生長調節因子的三維空間復合體，本文就組織工程技術修復軟骨缺損的研究進展進行綜述。

1 種子細胞

1.1 種子細胞的要求

理想的軟骨細胞種子細胞源要求具備：①取材方便，對機體的創傷較小；②體外擴增培養時增殖力強；③穩定的軟骨細胞表型可得以維持；④植入人體內免疫排斥反應小，生物安全性高；⑤黏附支架材料力強；⑥在植入受體內能對缺損軟骨有效修復，且有明確的遠期療效[7]。

1.2 種子細胞的來源

1.2.1 軟骨細胞 軟骨細胞是組織工程技術應用于軟骨修復中最早的一類種子細胞，其為終末分化細胞，且具有取材方便以及免疫排斥反應小的優點，是軟骨組織種子細胞的重要來源。自體軟骨細胞不存在免疫排斥反應，且通過自身取得軟骨組織后可通過胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶獲得純度較高的軟骨細胞。研究證明，來自體外的機械應力可促進軟骨細胞的分化、增殖以及增加細胞外基質的產生[8-10]。張仲文等[11]研究發現，自體軟骨細胞在10例膝關節軟骨缺損的患者修復中有效、安全，且在新形成的軟骨組織中為透明軟骨和纖維軟骨的混合體，以透明軟骨為主。但自體軟骨細胞存在不足：①三代以后的自體軟骨細胞出現生長緩慢、去分化、細胞表型改變等老化現象；②軟骨細胞會隨著供體年齡的增加活性下降；③自體軟骨細胞的來源局限，增殖率低，同時造成供應區疼痛及增加骨關節炎的發病率。

1.2.2 間充質干細胞 間充質干細胞的組織來源豐富，且增殖能力強。不同的間充質干細胞不會因為其來源不同而影響其多向分化的能力[12]。來自骨髓源的間充質干細胞可取自肋骨、髂骨、骨干，獲取方法簡單便行[13]；且具有多向分化潛能和高度自我更新的前體細胞[14-15]，因此骨髓間充質干細胞被認為是組織工程修復軟骨缺損的理想種子細胞來源[16]。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）已被證明自體移植不具有免疫排斥性，為安全的種子細胞源[17]。研究顯示，取犬骨髓分離培養BMSCs，并在軟骨細胞誘導液培養下，6周后可見軟骨陷窩，說明成熟軟骨細胞形成[18]。但BMSCs同樣具有缺陷：①分化成軟骨細胞所需的誘導條件較高；②重度骨關節炎患者BMSCs的成軟骨能力明顯減弱[19]；③BMSCs傳代至90代后可發生癌變。孫鵬浩[20]研究發現，BMSCs與軟骨細胞在體外長期培養下，其原癌細胞表達為陽性。脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）對供體損傷較小，且黏附及增殖能力僅與自體體制有關，是比較理想的種子細胞源[21]。且其不具有免疫抑制性，不易受到腫瘤細胞的污染，易于實現體外凈化。Winter等[22]通過實驗研究發現，BMSCs分化成軟骨細胞的能力弱于ADSCs，其證明BMSCs是軟骨組織工程中分化成軟骨能力最強的細胞。

1.2.3 胚胎干細胞 胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）具有良好的組織分化潛能以及高增殖活性，展現了良好的應用前景。Wakitani等[23]將ESCs移植到免疫抑制的關節軟骨缺損模型小鼠時，軟骨組織修復良好。Kramer等[24]研究認為，胚胎干細胞在體外自發分化成軟骨細胞的能力明顯優于骨髓干細胞。但存在胚胎干細胞來源困難、可能形成畸胎瘤、遺傳不穩定、培養過程中染色體異常等問題亟待解決。

1.3 種子細胞的培養方法

傳統的單層培養方式易發生去分化，僅用于軟骨細胞的初步培養。三維立體的培養體系尤為重要，靜止的三維培養體系為種子細胞提供根據軟骨缺損不規則形狀制成的三維支架，有利于保持相互間的通信和接觸以及獲得充足的營養物質。但可能存在種子細胞分布不均或者無法形成類似于體內動態環境[25]。而生物反應器營造類似集體的微環境，提供了一定的力學刺激，模擬機體微環境，使營養物質的給予更加合理和充分，同時促進軟骨細胞的增殖、分化以及基質合成，在形成軟骨上具有優勢。

2 支架材料

2.1 支架材料的要求

生物支架日漸趨于向復合性和功能性的方向發展，理想的支架材料應具有綜合性能。①材料：生物降解性和與組織生長率相適合的降解率；②結構：具有三維立體結構，80%孔隙率；③相容性：支架應與周圍組織無免疫原性；④細胞界面：良好的表面活性，適宜黏附，可提供良好的微環境；⑤可塑性：支架的結構可塑，且維持不變。

2.2 支架材料的來源

2.2.1 天然生物大分子蛋白 天然生物大分子蛋白的支架材料不但具有關節軟骨再生的理化特性，且具有良好的組織相容性、低細胞毒性、弱免疫原性以及自身可降解性，促進細胞的黏附、增殖以及分化等生物特性。但也因為易降解，常致提前坍塌生成不了新組織的不足。主要支架為：①膠原蛋白因其來源廣、低免疫原性、良好的生物相容性和安全性，可降解吸收以及便于加工成多種形狀在臨床上廣泛應用，但其存在缺乏機械強度難以用于軟骨缺損修復以及降解速率過快，且高純度的膠原獲取成本高等不足；Lee等[26]研究組織工程培育軟骨細胞時，選用Ⅱ型膠原作為生物支架培養種子細胞，發現在Ⅱ型膠原作為支架上增殖的軟骨細胞生長和功能情況均良好。②纖維蛋白來源廣泛，具有很好的生物相容性，不存在免疫排斥，且在凝血酶的作用下可塑、可黏附、可降解；然而其易發生急劇萎縮、退化以及機械強度較低；研究發現在自體骨髓間充質干細胞修復兔關節軟骨的研究中，復合富血小板纖維蛋白的支架可促進軟骨修復[27-28]。③殼聚糖因其良好的生物相容性、可降解性以及成型性等優勢[29]為重要的支架材料之一；林濤等[30]選用殼聚糖水凝膠作為支架，結果關節軟骨以一種完全結構性的形式得以良好修復。④天然脫細胞基質因其為自體或異種的組織或器官去除了細胞和可溶性蛋白等引起免疫反應的物質，得到的天然基質材料；楊自權等[31]利用牛關節軟骨脫細胞處理，制成既保留軟骨基質主要成分，又具備良好生物相容性和理化性質的多孔狀新型載體材料。

2.2.2 人工合成高分子聚合材料 人工合成高分子聚合材料大多采用仿生學理念[32-33]，合成替代細胞外基質的高分子材料，其主要優點為來源廣泛，可塑性強，能較好地誘導、促進軟骨細胞的黏附、增殖和分化，但仍存在親水性差，吸附力弱；降解產物不利于細胞生長以及具有一定免疫原性等不足。聚羥基乙酸（PGA）具有良好的組織相容性，其不足在于易降解，導致支架塌陷，其降解產物羥基酸可導致局部的pH偏小。陳哲峰等[34]研究使用PGA作為生物支架的材料，軟骨細胞易黏附，且可長時間的保持軟骨生物特性。聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物組織相容性良好，可降解。Vacanti等[35]最早利用PGA、PLA作為支架材料，可培養出軟骨細胞。但存在細胞不易黏附、降解率低、成本高等不足。

2.2.3 復合材料 復合材料是在兩種或兩種以上的不同材料上改性或進行仿生學處理后，揚長避短，形成優良特性的新材料。劉建斌[36]將殼聚糖-明膠/β-磷酸三鈣復合體作為組織工程軟骨支架材料進行研究，發現其具有良好的超微結構、機械性能和生物相容性。另外納米材料因其較好的靶性和一定的延展性，在組織工程化支架結構的研究及運用中得到了重視[37]。

3 細胞生長調節因子

軟骨定向誘導分化需要適合的刺激因子刺激和推動軟骨的分化，現已證明諸多細胞因子均可誘導或刺激軟骨細胞分化。TGF-β是目前誘導因子中研究最多且療效最好的因子之一[38-39]，對軟骨細胞的生長分化具有重要的作用。同志超等[40]用TGF-β2作為軟骨誘導的主要誘導劑，定向分化軟骨細胞，可見Ⅱ型膠原軟骨陷窩形成。IGF-1具有胰島素樣生物活性，又依賴生長激素，可調控軟骨細胞合成基質，增加軟骨蛋白，抑制正常細胞外基質降解，從而調節軟骨基質的合成和降解平衡[41]。付勤等[42]研究發現單層培養的條件下，外源性轉化生長因子TGF-β1和IGF-1可促進脂肪間充質干細胞可促進軟骨細胞定向分化，但TGF-β1的誘導效果要比IGF-1明顯，且兩種同時應用時具有協同作用。FGF主要以堿性成纖維生長因子（FGF2）和酸性成纖維生長因子（cFGF1）的形式存在，可刺激軟骨細胞的增殖和分化。BMPs是一類酸性糖蛋白，現有研究證明BMPs作為生物活性因子可以誘導間充質干細胞分化成軟骨細胞[43-44]。

4 總結和展望

軟骨組織工程是現代醫學界的前沿科學，利用組織工程技術修復軟骨缺損取得較大的成功[45]。安全高效的種子細胞源是這一技術的基礎和關鍵，但現有的種子細胞中尚未發現一種細胞完全符合組織工程修復軟骨缺損的要求。軟骨細胞免疫原性低，但存在三代以后去分化等的風險，BMSCs相對于ADSCs和臍帶間充質干細胞更具有分化成軟骨細胞的潛能，但是其安全性待進一步研究，其長期體外培養可能存在癌變風險。胚胎干細胞雖然具有高度未分化的生物特性，但是其安全問題同樣需要進一步研究。一個能與種子細胞產生理想和可控相互作用的支架是組織生物工程得以實施的重要環節，復合材料組成的三維支架滿足組織工程的需要。隨著生物材料學的發展，新型的支架材料投入組織工程研究中，仿生材料、改性及修飾材料將成為支架材料的熱點研究方向。細胞生長因子在軟骨細胞的定向分化中起著重要的作用。隨著軟骨定向分化因子研究的深入，新的細胞因子不斷被用于調控誘導種子細胞向軟骨方向轉化。組織工程修復軟骨缺損在臨床上的應用還存在諸多問題，必須遵循安全、有效及操作簡便的原則。種子細胞篩選、獲取以及進行體外培養問題，以及針對種子細胞的優化和安全問題；三維支架材料的仿生、改性及修飾問題；以及細胞生長因子的聯合和續貫使用問題，都是組織工程修復軟骨缺損的研究與臨床應用亟待解決的問題。相信組織工程技術為軟骨缺損的修復提供新的治療方式，同時也將促進組織工程的進一步發展。

[參考文獻]

[1] Sittinger M，Bujia J，Rotter N，et al. Tissue engineering and autologous transplant formation：practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques [J]. Biomaterials，1996，17（3）：237.

[2] Marijnissen WJ，van Osch GJ，Aigner J，et al. Alginate as a chondrocyte-delivery substance in combination with a non-woven scaffold for cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials，2002，23（6）：1511.

[3] Gobbi A，Nunag P，Malinowski K. Treatment of full thickness chondral lesions of the knee with microfracture in a group of athletes [J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2005，13（3）：213-221.

[4] Widuchowski W，Widuchowski J，Trzaska T. Articular cartilage defects：study of 25，124 knee arthroscopies [J]. Knee，2007，14（3）：177-182.

[5] Gross AE，Agnidis Z，Hutchison CR. Osteochondral defects of the talus treated with fresh osteochondral allograft transplantation [J]. Foot Ankle Int，2001，22（5）：385.

[6] Langer R. Tissue engineering [J]. Science，2000，260（5110）：920-926.

[7] 叢波，張仲文.軟骨組織工程種子細胞源的研究進展[J].中華災害救援醫學，2016，4（6）：341-344.

[8] Angele P，Yoo JU，Smith C，et al. Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro [J]. J Orthop Res，2003，21（3）：451-457.

[9] Worster AA，Brower-Toland BD，Fortier LA，et al. Chondrocytic differentiation of mesenchymal stem cells sequentially exposed to transforming growth factor-beta1 in monolayer and insulin-like growth factor-I in a three-dimensional matrix [J]. J Orthop Res，2001，19（4）：738.

[10] Campbell JJ，Lee DA，Bader DL. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells [J]. Biorheology，2006，43（3-4）：455-470.

[11] 張仲文，侯世科，楊造成，等.基質誘導的自體軟骨細胞移植術修復膝關節軟骨缺損10例術后2年的隨訪[J].中華關節外科雜志：電子版，2010，4（6）：734-741.

[12] Koga H，Engebretsen L，Brinchmann JE，et al. Mesenchymal stem cell-based therapy for cartilage repair：a review [J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2009，17（11）：1289-1297.

[13] Lu FZ，Fujino M，Kitazawa Y，et al. Characterization and gene transfer in mesenchymal stem cells derived from human umbilical-cord blood [J]. J Laboratory Clin Med，2005，146（5）：271-278.

[14] Grande DA，Mason J，Light E，et al. Stem cells as platforms for delivery of genes to enhance cartilage repair [J]. J Bone Joint Surg，2003，85（1）：111-116.

[15] 陳佳琦，陳慧敏.間充質干細胞的研究現狀與應用前景[J].北京生物醫學工程，2015，34（4）：435-438.

[16] Abdallah BM，Kassem M. Human mesenchymal stem cells：from basic biology to clinical applications [J]. Gene Ther，2008，15（2）：109-116.

[17] Kuroda R，Usas A，Kubo S，et al. Cartilage repair using bone morphogenetic protein 4 and muscle-derived stem cells [J]. Arthrit Rheumat，2006，54（2）：433-442.

[18] 李丹，周廣東，劉涓，等.骨髓間充質干細胞體外構建組織工程化半月板[J].組織工程與重建外科雜志，2013，9（5）：251-255.

[19] Murphy JM，Dixon K，Beck S，et al. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis [J]. Arthrit Rheumat，2002，46（3）：704-713.

[20] 孫鵬浩.軟骨細胞和骨髓間充質干細胞體外共培養的成瘤危險性的研究[D].南京：東南大學，2014.

[21] Estes BT，Diekman BO，Gimble JM，et al. Isolation of adipose-derived stem cells and their induction to a chondrogenic phenotype [J]. Nat Protocol，2010，5（7）：1294-1311.

[22] Winter A，Breit S，Parsch D，et al. Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids：a comparison of bone marrow–derived and adipose tissue-derived stromal cells [J]. Arthrit Rheumatol，2003， 48（2）：418-429.

[23] Wakitani S，Aoki H，Harada Y，et al. Embryonic stem cells form articular cartilage，not teratomas，in osteochondral defects of rat joints [J]. Cell Transplant，2004，13（4）：331-336.

[24] Kramer J，B？觟hrnsen F，Schlenke P，et al. Stem cell-derived chondrocytes for regenerative medicine [J]. Transplant Proceed，2006，38（3）：762-765.

[25] Ringe J，Kaps C，Burmester GR，et al. Stem cells for regenerative medicine：advances in the engineering of tissues and organs [J]. Sci Nat，2002，89（8）：338-351.

[26] Lee CR，Grodzinsky AJ，Spector M. Biosynthetic response of passaged chondrocytes in a type Ⅱ collagen scaffold to mechanical compression [J]. J Biomed Mater Res，2003， 64（3）：560.

[27] 張永濤.不連通雙層PLGA支架負載自體骨髓間充質干細胞與富血小板血漿的復合體修復骨軟骨缺損的實驗研究[D].廣州：南方醫科大學，2013.

[28] 張旭東，逯卓卉，陳偉，等.用組織工程學方法探討兔佐劑性關節炎關節軟骨修復的實驗研究[J].北京生物醫學工程，2016，35（2）：185-190.

[29] 于洪宇，馬春雨.殼聚糖-膠原凝膠復合骨髓間充質干細胞修復兔關節軟骨缺損的組織學變化[J].中國組織工程研究，2010，14（25）：4581-4584.

[30] 林濤，陳竹，袁德超，等.殼聚糖水凝膠復合脂肪間充質干細胞修復兔關節軟骨缺損[J].中華創傷雜志，2016， 32（4）：357-362.

[31] 楊自權，何君仁，李剛，等.可塑形脫細胞軟骨基質材料的制備及性狀研究[J].中國修復重建外科雜志，2008， 22（10）：1232-1237.

[32] Augst AD，Kong HJ，Mooney DJ. Alginate hydrogels as biomaterials [J]. Macromol Biosci，2006，6（8）：623-633.

[33] Adachi T，Osako Y，Tanaka M，et al. Framework for optimal design of porous scaffold microstructure by computational simulation of bone regeneration [J]. Biomaterials，2006，27（21）：3964-3972.

[34] 陳哲峰，范衛民，劉峰.利用PLA、PGA、PLGA三種支架再生兔關節軟骨[J].江蘇醫藥，2005，31（8）：599-601.

[35] Vacanti CA，Langer R，Schloo B，et al. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation [J]. Plast Reconstr Surg，1991，88（5）：753-759.

[36] 劉建斌.殼聚糖-明膠/β-磷酸三鈣復合體作為組織工程軟骨支架材料的實驗研究[J].組織工程與重建外科雜志，2010，6（6）：319-322.

[37] Dan K，Prabhakaran MP，Benjamin S，et al. Mechanical properties and，in vitro behavior of nanofiber-hydrogel composites for tissue engineering applications[J]. Nanotechnology，2012，23（9）：095705.

[38] Thorpe SD，Buckley CT，Vinardell T，et al. The response of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to dynamic compression following TGF-β3 induced chondrogenic differentiation [J]. Ann Biomed Engineering，2010， 38（9）：2896-2909.

[39] Bosnakovski D，Mizuno M，Kim G，et al. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）in different hydrogels：influence of collagen type Ⅱ extracellular matrix on MSC chondrogenesis [J]. Biotechnol Bioengineering，2006，93（6）：1152-1163.

[40] 同志超，楊鎮，同志勤，等.骨髓間質干細胞體外定向誘導分化為軟骨細胞的實驗研究[J].中國骨傷，2008，21（5）：362-364.

[41] Nixon AJ，Goodrich LR，Scimeca MS，et al. Gene therapy in musculoskeletal repair [J]. Ann New York Acad Sci，2007， 1117（1）：310-327.

[42] 付勤，王勇，于冬冬，等.外源性TGF-β1及IGF-1誘導大鼠脂肪干細胞向軟骨細胞分化的實驗研究[J].中國骨質疏松雜志，2007，13（12）：848-853.

[43] Hanada K，Solchaga LA，Caplan AI，et al. BMP-2 induction and TGF-beta 1 modulation of rat periosteal cell chondrogenesis [J]. J Cell Biochem，2001，81（2）：284-294.

[44] Matsumoto T，Kubo S，Meszaros LB，et al. The influence of sex on the chondrogenic potential of muscle-derived stem cells：implications for cartilage regeneration and repair [J]. Arthrit Rheumat，2008，58（12）：3809-3819.

[45] Guo XD，Du JY，Zheng QX，et al. Neocartilage formation in vitro using transduced mesenchymal stem cells cultured on biomimetic biodegradable polymer scaffolds [J]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2001，23（4）：373-377.

（收稿日期：2017-03-31 本文編輯：李亞聰）