Smad4在結直腸癌中的研究進展

宋丹+肖曠+鄭勇斌

[摘要] Smad4作為抑癌基因，其編碼的Smad4蛋白是轉化生長因子β（TGF-β）家族各類信號傳導過程中共同需要的介質，調控著細胞的增殖分化與凋亡。據文獻報道，Smad4在結直腸癌中扮演重要的角色，其低表達與腫瘤的發展呈負相關。國內外對Smad4在結直腸癌中的表達及其功能的研究有很大進展，本文就目前最新進展進行綜述。

[關鍵詞] 結直腸癌；Smad4；抑癌基因；轉化生長因子β

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（b）-0028-04

Research progress of Smad4 in colorectal cancer

SONG Dan XIAO Kuang ZHENG Yongbin▲

Department of Gastrointestinal Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， China

[Abstract] Smad4 protein，encoded by tumor-suppressing gene Smad4， is a signal transduction medium of TGF-βsignaling pathway， regulating the proliferation，differentiation and apoptosis of cells. It is reported that Smad4 plays an important role in colorectal cancer and low expression of Smad4 is negatively related to the colorectal cancer development. This paper mainly review the research progress on the expression and function of Smad4 in colorectal cancer at home and abroad.

[Key words] Colorectal cancer； Smad4； Anti-oncogene； TGF-β

結直腸癌在西方國家一直是最常見的惡性腫瘤疾病之一，近十年來，包括中國、韓國、新加坡在內的許多亞洲國家結直腸癌患病率較之前增長了2～4倍[1]。本文主要回顧Smad4在結直腸癌中的作用。Smad4作為抑癌基因，在結直腸癌中扮演重要的角色，同時，Smad4的低表達與腫瘤的發展呈負相關。Smad4在結直腸癌中的表達及其功能的研究有助于闡明腫瘤侵襲及轉移方面的機制，同時在治療方面將取得更大的突破。

1 Smad4基因的結構功能

Smad4基因位于核染色體18q21.1，核苷酸序列保存在GenBank的U44378中。該基因轉錄子長2680 bp，其編碼的Smad4蛋白由552個氨基酸殘基組成。Smad4蛋白是Smads蛋白家族的成員之一，根據其結構與功能分3個亞型：受體活化型（Receptor-activated Smads，R-Smads）、共享型（Common-mediator Smads，Co-Smads）、抑制型（Inhibitory Smads，I-Smads），其中Co-Smads即為Smad4。其一級結構分為3個區：N端區、C端區和中間連接區，N端區和C端區分別稱MH1和MH2，中間連接區富含脯氨酸。MH2缺失磷酸化結構SSXS，單獨存在不足以行使信號傳導功能，只有在部分中間連接區（Smad4的活性區）存在時方可傳遞信號[2-7]。

2 Smad4基因與TGF-β

轉化生長因子β（TGF-β）在細胞增殖、分化、轉移以及細胞存活、血管生成、免疫監視過程中是一個普遍存在且非常關鍵的調節因子。TGF-β信號通路中不同元素突變或刪失，以及抗TGF-β調節的抑制性增生常可導致各種腫瘤的發生。盡管TGF-β信號通路普遍被認為具有抑癌作用，但其通過對腫瘤細胞本身以及間質細胞的影響也可促進腫瘤的發生[8]。Sun等[9]在研究中發現，結直腸癌中Smad4的缺失可使TGF-β的抑癌作用轉化為促癌作用，但其具體機制有待于進一步研究。

Smads家族蛋白在TGF-β信號通路中具有不可替代性，在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用，且不同的Smad蛋白介導不同的TGF-β家族成員的信號轉導。TGF-β作為配體形成的受體復合物，激活Smads進入核內，共同激活或抑制它們調節的靶基因的轉錄。同時，Smad4作為TGF-β超家族受體的直接底物，對惡性腫瘤的發生、發展及轉移具有重要影響。

3 Smad4基因與CRC

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的發生發展是一個包括遺傳與環境等多因素相互作用的結果。在所有因素中，染色體不穩定性（chromosome instability，CIN）是影響結直腸癌進展的主要通路之一，其中主要包括APC、p53和DCC/Smad4等的缺失[10]。特別是Smad4在結直腸癌發生發展過程中的抑癌機制不可忽視，因此，探索Smad4基因對于結直腸癌的診斷及治療均有重要的作用。

3.1 Smad4與CRC的發生及發展

抑癌基因Smad4是TGF-β信號通路中重要的轉錄因子，在結直腸癌等消化道腫瘤中常常發生基因變異，包括染色體片段丟失、基因突變以及基因的表達異常。Demagny等[11]發現Smad4 Pro130Ser與Asn351His的突變可加強糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的磷酸化，從而抑制Smad4的活性及穩定性，同時GSK-3活性被抑制可恢復細胞中TGF-β信號，說明抑癌基因Smad4的點突變可通過GSK-3的磷酸化作用從而可逆地使TGF-β信號失活。闡明了Smad4在TGF-β信號通路中的作用，同時提示GSK-3抑制劑可提高Smad4點突變蛋白的穩定性，并恢復有類似突變癌細胞的TGF-β正常信號，為出現一種新的治療方式提供可能。Inamoto等[12]對333例早期結直腸癌標本的研究以及在原位異種移植模型上探討Smad4缺失與腫瘤生長的關系，發現Smad4缺失的CRC細胞分泌的趨化因子（CCL15）可募集趨化因子受體（CCR1）+的細胞，導致早期腫瘤出現侵襲性生長。免疫組化結果表明Smad4與CCL15的表達顯著相關，在CRC入侵之前，分泌CCL15+的早期CRC細胞所募集的CCR1+的細胞大約是分泌CCL15-的2.2倍。重要的是，這些CCR1+的細胞主要是骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）（CD11b+、CD33+、HLA-DR-）。大多數CCR1+細胞表現為粒細胞樣的MDSC（CD14+），也有部分為單核細胞樣的MDSC（CD14+）。同時，研究中發現CRC患者血清CCL15水平顯著高于對照組。據此，阻斷MDSCsCCR1+的募集可能是一種新奇的分子靶向治療方法，血清CCL15的濃度也可作為CRC新的生物標志物。Voorneveld等[13]在細胞水平及動物模型上對BMP信號通路與Smad4的關系的研究發現，激活Smad4缺失細胞的BMP信號通路能改變標志上皮間質轉化過程的蛋白及mRNA水平，并能增加細胞的轉移與侵襲能力以及細胞偽足的形成。體外敲出Smad4缺失細胞的BMP受體可降低其侵襲能力，因此發現Smad4缺失與患者不良預后的這種關系依賴于BMP受體的表達而非TGF-β受體的表達，因此尋求一種干擾非依賴Smad4的BMP信號通路的藥物可作為治療CRC的新手段。近年來，關于microRNA在腫瘤發生發展中潛在作用的探究越來越成為熱點，為了闡明CRC患者中microRNA-130a/301a/454家族與samd4之間的關系，Liu等[14]研究發現相比于鄰近正常黏膜，CRC組織中microRNA-130a/301a/454家族被上調。在CRC HCT116與SW480細胞中，microRNA-130a/301a/454可增強細胞的增殖與轉移能力，同時發現關于miRNAs的抑制因素與細胞的生存狀況關系密切。值得注意的是，microRNA-130a/301a/454在CRC細胞中的生物學功能是通過抑制Smad4來調節的，在人CRC中，microRNA-130a/301a/454的上調與Smad4的下調相聯系。除此以外，Cheng等[15]通過轉染等各種技術研究發現，在人CRC細胞中，miR-20a-5p通過調節Smad4基因的3′UTR也可使Smad4蛋白表達降低。miR-20a-5p不僅可以增強CRC細胞在體外的增值能力及在體的肝轉移能力，還可以通過下調Smad4的表達促進上皮間質轉化。同時，通過對544例CRC患者標本的組織微陣列分析發現，miR-20a-5p在人CRC組織中表達上調，特別是在轉移組織中。高水平miR-20a-5p被證實預示CRC患者的不良預后。

Smad4缺失即為微衛星不穩定性（MSI）較為典型的情況，早有學者提出MSI是腫瘤形成的機制之一[16]，Isaksson-Mettavainio等[17]研究了Smad4的表達量對MSI型CRC患者預后的影響，發現Smad4的高表達可以明顯提高MSI型CRC患者的生存率。據文獻報導，Smad通路與非Smad通路還存在相互調控作用，張梅慶等[18]通過對53 例臨床病理標本的免疫組化分析，探討Smad與蛋白激酶B（PKB）通路的相關性，發現Smad4 表達下降還可能通過激活PKB通路促進CRC的進展，但其具體機制還有待于進一步闡明。

在腫瘤生長過程中，腫瘤組織本身的營養供給狀況在腫瘤的發展中占有主要地位，在對腫瘤組織的血管及淋巴管生成的研究中， Yang等[19]發現PSG9/Smad4復合體可募集細胞質中Smad2/3使其成為復合體，從而促進Smad4在胞核中滯留，PSG9/Smad4復合體還可增強與血管生成相關的多重基因（IGFBP-3，PDGF-AA，GM-CSF，和VEGFA）的表達。另外通過對140例CRC患者與125例正常組的血清PSG9水平的對比以及對74組腫瘤組織及其相鄰正常組織PSG9水平的檢測發現，CRC患者的血清及腫瘤組織中，PSG9都顯著升高。且其升高水平與患者預后及微脈管密度負相關。體外研究證實PSG9的過表達明顯促進HCT-116與HT-29細胞的增值與轉移，同時，PSG9的水平降低可抑制SW-480細胞的增殖。通過在人臍血管內皮細胞上研究促血管發生實驗證實PSG9還可促進血管生成。其后的免疫共沉淀實驗證明了PSG9與Smad4的這一相關性。Smad4作為TGF-β信號通路中重要的下游調節因子，對CRC的抑癌作用明顯，但其對CRC的淋巴管生成影響一直未明。Liu等[20]研究了Smad4對淋巴管生成的潛在抑制作用以及在結腸癌中與VEGF-C分泌的相關性。發現，Smad4可抑制VEGF-C的分泌，并抑制淋巴管的生成，從而降低腫瘤的轉移及侵襲能力。

3.2 Smad4與CRC的轉移

早前Tian等[21]在體外細胞水平上發現高表達Smad4的sw480癌細胞株在培養過程中細胞遷移率明顯減少，而近十年來，國內外出現了較多對Smad4缺失在CRC轉移中具體機制的探討。Itatani等[22]通過對人CRC細胞中Smad4調節CCL15表達的能力的研究以及對141例CRC肝轉移標本的研究發現，在人CRC細胞中，Smad4的缺失不僅可以上調CCL15的表達，而且在表達CCL15的肝轉移組織中含有更高水平的CCR1+細胞，這些發生肝轉移的病人出現更低的生存率。提示可以阻斷CCL15募集CCR1+細胞的藥物來防止CRC的肝轉移。Yamamoto等[23]對小鼠模型的研究以及對107例CRC肺轉移臨床標本的檢測發現，缺失Smad4可通過CCL15-CCR1軸積累CCR1+腫瘤相關中性粒細胞來促進CRC細胞的肺轉移能力。同時根據劉巖青等[24]對112例CRC患者的最新臨床研究以及陳小會等[25]對99例CRC患者的臨床標本的研究發現，CRC中Smad4低表達與肝轉移相關，且是CRC肝轉移的獨立影響因素，可作為預測CRC肝轉移的生物學指標。

3.3 Smad4與CRC患者的預后

目前，CRC患者的預后主要根據臨床病理分期判定，這對預后的評價的合理性有待于提高，因此越來越多的研究從分子機制層面探討某些分子標志物與患者預后的關系。其中，Smad4基因在CRC預后方面的研究一直是科研中的熱點，為了證明Smad4的表達情況與CRC患者結局是否相關，Kozak等[26]在2005～2009年連續收集了241例CRC患者的標本及其臨床病理記錄，對其癌組織及其正常組織通過微陣列進行分析，并通過免疫組化檢測Smad4的表達情況。結果241例腫瘤中有21例Smad4表達陰性。后期對患者的跟蹤調查進一步發現，Smad4陰性相對于Smad4陽性患者有著不良預后。早前Voorneveld等[27]對137個文獻的數據歸納分析也進一步證明，免疫組化檢測Smad4表達情況可作為患者預后情況的標志。傳統醫療過程中，常以臨床病理結果來評價CRC肝轉移切除術后的復發率，其預后與相關的分子標記物的關系并不清楚，López-Gómez等[28]對121例患者進行研究后發現，Smad4和TS的表達情況與CRC肝轉移切除術后的復發風險相關，此發現有利于更科學的彌補在以臨床病理為基礎的評價體系中的不足。Wang等[29]通過免疫組化及微陣列對112例標本進行分析發現，COUP-TF Ⅱ的高表達與Smad4陰性均提示CRC患者的不良預后。Chun等[30]通過對201例直腸癌（三期）標本通過免疫組化檢測了TGF-β1、TGF-βⅡ型受體，Smad3、Smad4以及Smad7蛋白的表達，結果發現TGF-β1低表達與患者的不良預后相關。王星權等[31]對134例CRC患者的跟蹤調查發現，CRC組織中具有Smad4高表達的患者，其術后總體生存期較低表達組患者為好。Smad4缺失不僅影響CRC的發生發展轉移及預后，同時影響著CRC的化療效果，Zhang等[32]研究發現了Smad4調節5-FU的化療敏感性的新機制，即通過抑制PI3K/Akt/CDC2/凋亡抑制蛋白級聯反應阻礙細胞周期。最近相關研究也證明LY294002逆轉Smad4低表達的CRC患者的化療敏感性的潛在療效。因而關于這方面的研究將有利于提高CRC患者的預后。以上均提示，Smad4的缺失預示著患者的不良預后，所以Smad4蛋白有望作為評價CRC患者預后的重要蛋白標志物。

4 展望

目前，Samd4在腫瘤發生發展及轉移過程中的分子生物學方面的研究還在不斷深入，同時Smad4作為CRC患者評價預后的分子標志物越來越得到大家的認可。但目前尚缺乏一個Smad4缺失并模擬人體散發性癌灶的CRC動物模型，從而更詳盡地研究Smad4在CRC發生發展及轉移中的機制，以及在腫瘤發生發展的整個過程中，Smad4與腫瘤局部免疫狀況的關系及其在致瘤中的地位，因此有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1] Sung JJ，Lau JY，Goh KL，et al. Increasing incidence of colorectal cancer in Asia：implications for screening [J]. Lancet Oncol，2005，6（11）：871-876.

[2] 姚紫州，陳嘉勇，梁道明. Smad4在結直腸腫瘤中的研究進展[J].重慶醫學，2013，42（24）：2923-2925.

[3] 周信遠，王琛.抑癌基因DPC4/SMAD4在消化系統腫瘤的研究進展[J].中華臨床醫師雜志：電子版，2012，6（7）：1822-1824.

[4] 魏松鋒，黃亮，張艷，等. PTEN、Smad4在腫瘤發生、發展中作用的研究進展[J].現代腫瘤醫學，2011，19（2）：376-379.

[5] 閆繼東. Smad4在腫瘤中的研究進展[J].中外醫療，2010， 29（19）：186-187.

[6] 余守強，楊小龍，丁伯應. Smad4在消化系統常見惡性腫瘤中的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2009，14（21）：1714-1716.

[7] 朱玉萍，李德川. Smad4基因在結直腸癌中的研究進展[J].實用癌癥雜志，2008，23（4）：433-434.

[8] Elliott RL， Blobe GC. Role of transforming growth factor Beta in human cancer [J]. J Clin Oncol，2005，23（9）：2078-2093.

[9] Sun G，Cao D，Sun Z，et al. TGF-beta promotes colorectal cancer cell growth in vitro and in vivo [J]. Hepatogastroenterology，2013，60（124）：715-719.

[10] 徐銘，劉炳亞.染色體不穩定性與腫瘤[J].醫學分子生物學雜志，2006，3（6）：430-433.

[11] Demagny H，De Robertis EM. Point mutations in the tumor suppressor Smad4/DPC4 enhance its phosphorylation by GSK3 and reversibly inactivate TGF-beta signaling [J]. Mol Cell Oncol，2016，3（1）：e1025181.

[12] Inamoto S，Itatani Y，Yamamoto T，et al. Loss of SMAD4 promotes colorectal cancer progressionby accumulation of myeloid-derived suppressor cells through the CCL15-CCR1 chemokine axis [J]. Clin Cancer Res，2016，22（2）：492-501.

[13] Voorneveld PW，Kodach LL，Jacobs RJ，et al. Loss of SMAD4 alters BMP signaling to promote colorectal cancer cell via rho rocK [J]. Gastroenterology，2014，147（1）：196-208.

[14] Liu L，Nie J，Chen L，et al. The oncogenic role of microRNA-130a/301a/454 in human colorectalcancer via targeting Smad4 expression [J]. PLoS One，2013，8（2）：e55532.

[15] Cheng D，Zhao S，Tang H，et al. MicroRNA-20a-5p promotes colorectal cancer invasion andmetastasis by downregulating Smad4 [J]. Oncotarget，2016，7（29）：45199-45213.

[16] Mori Y，Selaru FM，Sato F，et al. The impact of microsatellite instability on the molecularphenotype of colorectal tumors [J]. Cancer Res，2003，63（15）：4577-4582.

[17] Isaksson-Mettavainio M，Palmqvist R，Dahlin AM，et al. High SMAD4 levels appear inmicrosatellite instability and hypermethylated colon cancers，and indicate a better prognosis[J]. Int J Cancer，2012，131（4）：779-788.

[18] 張梅慶，傅向平，胡映東，等.人結腸癌組織中Smad 4與蛋白激酶B表達水平相關性及與臨床病理的關系研究[J].現代腫瘤醫學，2014，22（8）：1871-1874.

[19] Yang L，Hu S，Tan J，et al. Pregnancy-specific glycoprotein 9 （PSG9），a driver for colorectalcancer，enhances angiogenesis via activation of SMAD4 [J]. Oncotarget，2016， 7（38）：61562-61574.

[20] Liu Y，Sheng J，Dai D，et al. Smad4 acts as tumor suppressor by antagonizing lymphangiogenesis in colorectal cancer [J]. Pathol Res Pract，2015，211（4）：286-292.

[21] Tian X，Du H，Fu X，et al. Smad4 restoration leads to a suppression of Wnt/beta-catenin signalingactivity and migration capacity in human colon carcinoma cells [J]. Biochem Biophys Res Commun，2009，380（3）：478-483.

[22] Itatani Y，Kawada K，Fujishita T，et al. Loss of SMAD4 from colorectal cancer cells promotes CCL15 expression to recruit CCR1+ myeloid cells and facilitate liver metastasis [J]. Gastroenterology，2013，145（5）：1064-1075.

[23] Yamamoto T，Kawada K，Itatani Y，et al. Loss of SMAD4 promotes lung metastasis of colorectal cancer by accumulation of CCR1+ tumor-associated neutrophils through CCL15-CCR1 axis [J]. Clin Cancer Res，2017，23（3）：833-844.

[24] 劉巖青，盛吉章，孫鳳莉，等. FHL1和Smad4 在結直腸癌中的表達及與肝轉移的關系[J].廣東醫學，2016，37（2）：215-218.

[25] 陳小會，盧啟明. Smad4的表達與結直腸癌肝轉移的關系[J].廣東醫學，2013，34（8）：1182-1185.

[26] Kozak MM， von Eyben R，Pai J，et al. Smad4 inactivation predicts for worse prognosis andresponse to fluorouracil-based treatment in colorectal cancer [J]. J Clin Pathol，2015， 68（5）：341-345.

[27] Voorneveld PW，Jacobs RJ，Kodach LL，et al. A meta-analysis of SMAD4 immunohistochemistry as a prognostic marker in colorectal cancer [J]. Transl Oncol，2015，8（1）：18-24.

[28] López-Gómez M，Moreno-Rubio J，Suárez-García I，et al. SMAD4 and TS expression mightpredict the risk of recurrence after resection of colorectal liver metastases [J]. Clin Transl Oncol，2015，17（2）：133-138.

[29] Wang C，Zhou Y，Ruan R，et al. High expression of COUP-TF II cooperated with negative Smad 4 expression predicts [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（6）：7112-7121.

[30] Chun HK，Jung KU，Choi YL，et al. Low expression of transforming growth factor beta-1 incancer tissue predicts a poor prognosis for patients with stage Ⅲ rectal cancers [J]. Oncology，2014，86（3）：159-169.

[31] 王星權，王亞洲，陳玉強，等. Smad-4在結直腸癌的表達及評價患者預后的研究[J].黑龍江醫藥科學，2015， 38（6）：77-78， 80.

[32] Zhang B，Leng C，Wu C，et al. Smad4 sensitizes colorectal cancer to 5-fluorouracil through cellcycle arrest by inhibiting the PI3K/Akt/CDC2/survivin cascade [J]. Oncol Rep，2016，35（3）：1807-1815.

（收稿日期：2017-03-27 本文編輯：李岳澤）