兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定體系的建立

鄧辰紅++王飛++王文蘭

[摘要] 目的 探討兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定體系的建立方法與效果。 方法 空氣栓塞的方式處死SPF級(jí)新西蘭大白兔6只，分離骨髓組織，利用貼壁培養(yǎng)分離純化兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，多次傳代后以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原；以BrdU標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注入兔顱內(nèi)，分別于注射1、3周后取腦組織制作石蠟切片，進(jìn)行免疫熒光染色。 結(jié)果 通過貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞可獲得較純化的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中CD44+細(xì)胞率超過90%，細(xì)胞核未著色；流式細(xì)胞儀測(cè)定培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的CD90+細(xì)胞率為94.5%，CD34+細(xì)胞率為0.24%。BrdU標(biāo)記顯示得到了能夠摻DNA合成期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞所占的比例在40.0%以上。 結(jié)論 通過貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞呈多角短梭形，可獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，BrdU可作為體內(nèi)示蹤骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。

[關(guān)鍵詞] 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；培養(yǎng)與鑒定體系；BrdU；免疫組化；流式細(xì)胞儀

[中圖分類號(hào)] R329 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（b）-0020-03

Culture and identification of rabbit bone marrow stromal stem cells

DENG Chenhong1 WANG Fei2 WANG Wenlan1

1.Department of Pediatrics， Inner Mongolia People's Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010017， China； 2.Department of Orthopaedics， Inner Mongolia People's Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010017， China

[Abstract] Objective To investigate the methods and effects of the establishment and identification of rabbit bone marrow stromal stem cells. Methods 6 New Zealand rabbits of SPF grade were selected and sacrificed， and the bilateral femoral bone were separated and the bone marrow was given to aspiration， the rabbit bone marrow stromal stem cells were separated and purified by adherent culture method， after several passages， the cell surface antigen was detected by flow cytometry. And the BrdU was used to label bone marrow stromal stem cells. And the bone marrow stromal stem cells were injected into the rabbit brain，1 and 3 weeks after the brain for paraffin sections and immunofluorescence staining. Results The purified bone marrow stromal cells could be obtained by adherent culture method. Immunocytochemical staining showed that the CD44+ cell rate in bone marrow stromal stem cells was over 90%， and the nuclei were not stained. The CD90+ cell rate and CD34+ cell rate in cultured bone marrow stromal cells by flow cytometry were 94.5% and 0.24%. BrdU markers showed that bone marrow stromal cells could be synthesized into DNA， and the percentage of labeled cells was above 40%. Conclusion The cultured rabbit bone marrow cells are polygonal， juvenile short spindle， it can obtain purified bone marrow stromal stem cells， BrdU can be used as one of the ideal markers of bone marrow stromal stem cells in vivo.

[Key words] Bone marrow stromal cells； Culture and identification system； BrdU； Immunohistochemistry； Flow cytometry

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，骨組織工程技術(shù)在修復(fù)骨缺損中的研究越來越深入，其中種子細(xì)胞主要來源于骨、骨外膜、骨髓、骨外組織等[1-2]。其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)和體外均能成骨，而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是指存在于骨髓基質(zhì)中的非造血干細(xì)胞，其具有多分化潛能，在一定的條件下可以轉(zhuǎn)化成血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、纖維系細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨系細(xì)胞等[3-5]。并且骨髓基質(zhì)干細(xì)胞取材方便，體外培養(yǎng)體系比較方便，能在較短時(shí)間內(nèi)得到數(shù)量較多并易定向分化為成骨細(xì)胞，生物毒性低，當(dāng)前應(yīng)用越來越廣泛[6-7]。如何有效地分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是建立誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)[8]。BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，它也能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶滲入正在復(fù)制的DNA分子，從而BrdU檢測(cè)能夠反應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖狀態(tài)[9]。其在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用也具有安全、敏感性好、簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)勢(shì)；特別是在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中，BrdU可產(chǎn)生一種對(duì)比度高的標(biāo)記，應(yīng)用更加方便[10]。本文具體探討了基于BrdU染色的兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定體系的建立方法與效果。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

選擇SPF級(jí)新西蘭大白兔12只[2月齡，體重2～2.5 kg，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)為XP2001332]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的取得及手術(shù)方式通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

胎牛低血清培養(yǎng)基DMEM、IMDM來自Sigma公司，青霉素與鏈霉素來源于上海新華治藥廠（批號(hào)：201221，2012213），氯丙嗪為市售產(chǎn)品，NaCl等生化分析試劑為分析純。

1.2 研究方法

1.2.1 原代兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的取材及分離培養(yǎng)

將6只新西蘭大白兔采用空氣栓塞的方式處死，消毒后取出兩側(cè)的股骨，選擇肝素生理鹽水進(jìn)行沖洗，將沖出的骨髓細(xì)胞加入至容量為200 mL的專用IMDM培養(yǎng)液中，1500 r/min離心10 min，在沉淀物中加入IMDM培養(yǎng)液混勻繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后更換一半培養(yǎng)液，以后每隔2 d更換一半的培養(yǎng)液，等到7～8 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞特性觀察與鑒定

選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，運(yùn)用多聚甲醛固定后進(jìn)行CD44免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行結(jié)果判定，按染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色（0分），淡黃（1分），棕黃（2分），棕褐（3分）。按著色細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%（0分），6%～25%（1分），26%～50%（2分），≥51%（3分）；根據(jù)兩項(xiàng)積分之和判定其結(jié)果，<3分為陰性（-），≥3分為陽(yáng)性（+），≥4分為弱陽(yáng)性（++），≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

然后將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行表面CD44、CD71、CD90表達(dá)情況檢查，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.2.3 標(biāo)記骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)研究

在6只實(shí)驗(yàn)兔顱內(nèi)注射經(jīng)過BrdU標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，注射1周和3周后分別處死3只，在穿刺點(diǎn)選擇樣本制作石蠟切片，進(jìn)行免疫熒光染色，選擇同一個(gè)組織切片隨機(jī)選擇6個(gè)不同的視野，陽(yáng)性率=視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

選擇SPSS 20.00軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)采用百分比表示，計(jì)量資料數(shù)據(jù)選擇均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

分離的兔原代細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后細(xì)胞基本呈小球形，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后可以發(fā)現(xiàn)貼壁的紡錘細(xì)胞數(shù)量增加，并且呈成簇分布，培養(yǎng)10 d后細(xì)胞成片生長(zhǎng)；傳代培養(yǎng)3 d后增殖迅速（圖1，封三）；繼續(xù)傳代培養(yǎng)增殖速度進(jìn)一步加快，細(xì)胞連接緊密，長(zhǎng)梭形，出現(xiàn)漂浮的死細(xì)胞（圖2，封三）。

2.2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

將第二代髓核細(xì)胞爬片后，用Anti-CD44進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，髓核細(xì)胞胞漿呈棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)，CD44+細(xì)胞率超過90%，細(xì)胞核未著色（圖3，封三）。

流式細(xì)胞儀測(cè)定培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的CD90+細(xì)胞率為94.5%，CD34+細(xì)胞率為0.24%，表明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（圖4）。

2.3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外標(biāo)記效果

BrdU標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注射幼兔顱內(nèi)后，在免疫組化中選擇相同的組織片中6個(gè)視野不同進(jìn)行觀察，標(biāo)記細(xì)胞所占的比例在40.0%以上（圖5，封三）。

3 討論

骨髓基質(zhì)細(xì)胞為一種不具有造血功能的細(xì)胞，具有容易取材、多向分化、體外擴(kuò)增等多種優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)前在基礎(chǔ)研究與臨床上應(yīng)用比較多見[11]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在外在因素的刺激下可以進(jìn)一步向成軟骨、成骨、脂肪以及纖維細(xì)胞系等[12]。現(xiàn)代研究表明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可與造血干細(xì)胞直接反應(yīng)，并通過分泌生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化，支持和維持造血微環(huán)境[13-14]。

分離和純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的基本原則為細(xì)胞的黏附性，主要方法為梯度離心法來獲得干細(xì)胞等[15]。本研究通過貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞可獲得較純化的細(xì)胞，并能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)。免疫排斥反應(yīng)是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植所面臨的主要問題[16]。在鑒定兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中，髓基質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原具有非專一性，CD29、CD44、CD105、CD166等是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的重要標(biāo)志物[17]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能在異體內(nèi)存活時(shí)間較長(zhǎng)及有著免疫抑制效果，同時(shí)有多器官歸巢能力[18]。本研究顯示免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CD44+細(xì)胞率超過90%，細(xì)胞核未著色；流式細(xì)胞儀測(cè)定培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的CD90+細(xì)胞率為94.5%，CD34+細(xì)胞率為0.24%，說明本試驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。

隨著熒光基因與示蹤標(biāo)記技術(shù)的不斷完善和成熟，為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用打下很好的基礎(chǔ)[19]。比如綠色熒光蛋白能夠完整監(jiān)測(cè)示蹤完整活細(xì)胞生命現(xiàn)象，能夠觀察外源性成骨細(xì)胞植入體內(nèi)后的轉(zhuǎn)歸與功能[20-21]。BrdU可摻入DNA合成期的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，無需DNA變性即可有效檢測(cè)，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，能在細(xì)胞和組織水平能更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖等現(xiàn)，也可有效避免樣品損傷[22]。

總之，通過貼壁法培養(yǎng)幼年兔骨髓細(xì)胞呈多角短梭形，可獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，BrdU可作為體內(nèi)示蹤骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李東，毛豪麗，白珊珊，等.種植體聯(lián)合骨組織工程技術(shù)修復(fù)犬下頜骨節(jié)段缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].組織工程與重建外科雜志，2016，12（5）：285-288.

[2] Shen LH，Chen J，Shen HC，et al. Possible mechanism of therapeutic effect of 3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one and bone marrow stromal cells combination treatment in rat ischemic stroke model [J].Chin Med J，2016，129（12）：1471-1476.

[3] 王婷婷，何愛娟，劉豫，等.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增體系研究[J].組織工程與重建外科雜志，2016，12（3）：152-155，159.

[4] Di Rosa F. Commentary：memory CD8+ T cells colocalize with IL-7+ stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription [J].Front Immunol，2016，31（7）：102-109.

[5] 陳晨，張剛，谷銘勇，等.骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)骨形成和骨吸收的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2016，22（1）：120-124.

[6] Ma Q，Cai M，Shang JW，et al. In vitro neural differentiation of bone marrow stromal cells induced by hepatocyte growth factor and glial cell derived neurotrophic factor [J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（22）：4654-4663.

[7] 崔曉萍，陳建梅，穆軍山，等. PI3K-AKT通路對(duì)腦缺血損傷神經(jīng)干細(xì)胞的增殖作用[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2016， 31（2）：154-159.

[8] Wang H，Zhao Z，Du J，et al. MiRNA-378 controls cell proliferation in rabbit umbilical cord mesenymal stem cells [J]. Cell Mol Biol，2016，62（12）：97-101.

[9] 張黎龍，路磊，張學(xué)利，等.富血小板血漿誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，32（2）：5891-5896.

[10] Fayyad-Kazan H，F(xiàn)aour WH，Badran B，et al. The immunomodulatory properties of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells are defined according to multiple immunobiological criteria [J]. Inflamm Res，2016， 65（6）：501-510.

[11] Cortes-Dericks L，F(xiàn)roment L，Kocher G，et al. Human lung-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium exerts in vitro antitumor effects in malignant pleural mesothelioma cell lines [J]. Stem Cell Res Ther，2016，9（7）：25-32.

[12] Huang H，Yang X，Bao M，et al. Ablation of the sox11 gene results in clefting of the secondary palate resembling the pierre robin sequence [J]. J Biol Chem，2016，291（13）：7107-7118.

[13] 張欣，賀曉生. Toll樣受體4表達(dá)對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響[J].中華神經(jīng)外科雜志，2016，32（11）：1156-1161.

[14] Deane JA，Ong YR，Cain JE，et al. The mouse endometrium contains epithelial， endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase [J]. Mol Hum Reprod，2016，22（4）：272-284.

[15] Song L，Zhu J，Zhang X，et al. BDNF-hypersecreting human umbilical cord blood mesenchymal stem cells promote erectile function in a rat model of cavernous nerve electrocautery injury [J]. Int Urol Nephrol，2016，48（1）：37-45.

[16] Kusuma GD，Menicanin D，Gronthos S，et al. Ectopic bone formation by mesenchymal stem cells derived from human term placenta and the deciduas [J]. PLoS One，2015， 10（10）：e0141246.

[17] 楊曉紅，王勝男，劉慶余，等. Nrf2通過上調(diào)自噬促進(jìn)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2016，37（4）：481-489.

[18] Gu J，Gu W，Lin C，et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells improve the immune-associated inflammatory and prothrombotic state in collagen type-Ⅱ-induced arthritic rats [J]. Mol Med Rep，2015，12（5）：7463-74670.

[19] Bickford PC，Kaneko Y，Grimmig B，et al. Nutraceutical intervention reverses the negative effects of blood from aged rats on stem cells [J]. Age，2015，37（5）：103-109.

[20] Pirzad Jahromi G，Shabanzadeh Pirsaraei A，Sadr SS，et al. Multipotent bone marrow stromal cell therapy promotes endogenous cell proliferation following ischemic stroke [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol，2015，42（11）：1158-1167.

[21] Li H，Li X，Zhang M，et al. Three-dimensional co-culture of BM-MSCs and eccrine sweat gland cells in Matrigel promotes transdifferentiation of BM-MSCs [J]. J Mol Histol，2015，46（4-5）：431-438.

[22] 王盼，單偉.局部聯(lián)合移植hUCMSCs與VEGF對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（11）：17-19.

（收稿日期：2017-04-11 本文編輯：李岳澤）