草魚凝集素分子的基因克隆與進化分析

米亞雙++程傳波

草魚是我國重要的養殖淡水魚，其產量以及產值居于魚類養殖業的前列。凝集素是一類具有糖結合專一性，并與之非共價可逆結合的非酶、非免疫來源的蛋白質，其中把活性依賴于Ca2+者稱為C型凝集素。C型凝集素都具有一個或多個糖結構識別域（Carbohydrate-recognition domain，CRD）。魚類中所存在的天然凝集素分子在其非特異性免疫中占據重要地位，是魚類抵御異己物質入侵的一道防線。

材料與方法

材料。在超市購買健康的草魚，體長大約為30cm，體重為1.47kg。

方法。（1）草魚凝集素基因的克隆：從草魚組織中提取草魚RNA，并通過RT-PCR技術克隆獲得草魚凝集素基因。采用反轉錄試劑盒合成cDNA。以草魚的cDNA為模板，根據已設計好的引物，運用PCR技術獲得草魚凝集素基因。根據草魚凝集素的保守CRD設計引物，CILECF：ATGGAAGATATTGAAAATTACACCA，CILECR：GATATCATGTTAAGTGTGTGATAGGATCCATCTC。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s；56℃退火40s；72℃延伸40s；25個循環，72℃延伸10min。最后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。（2）TA克隆：將PCR產物與pEASY-T1Simple vector載體連接。鏈接產物轉化DH5α感受態，挑單克隆進行菌落PCR鑒定。將鑒定的陽性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。（3）構建進化樹：在GenBank中查找不同物種C型凝集素，下載其氨基酸序列。利用SMART對各物種凝集素的二級結構中的結構域進行了初步分析。用Clustalx軟件對所選物種的凝集素CRD的氨基酸序列進行多重序列比對。再結合分子生物學分析軟件MEGA4.0將比對結果以鄰接法（NJ法）構建系統進化樹。

結果

草魚凝集素基因克隆結果。實驗結果顯示在草魚肝和腸組織中擴增出800bp左右的片段，與預期一致。

草魚凝集素基因全長序列分析。用生物信息學在線分析軟件對草魚凝集素基因的測序結果進行分析（如圖1），草魚凝集素基因的開放閱讀框的長度為為795bp，編碼一個由264個氨基酸殘基組成的蛋白質，其蛋白質的相對分子質量為29868.1，等電點為5.03，46～68aa為跨膜區，125～256aa為CRD。氨基酸序列上的第125、136、153、232、247、255位置上含有6個高度保守的半胱氨酸殘基（三角內），并且該凝集素只有一個CRD（下劃線部分）。氨基酸序列還含有一個結合甘露糖的糖識別結合位點即EPN基序（橢圓內）和一個作為C型凝集素重要標志的WIGL序列（矩形內）。

草魚凝集素的系統進化分析。用生物信息學MEGA4.0以鄰接法（NJ法）構建草魚，斑馬魚，鯽魚，雀鱔，原雞，家鼠，牛，人等C型凝集素蛋白的系統進化樹。從圖2可以看出系統進化樹分為三大支，草魚同斑馬魚，鯽魚，雀鱔，白斑狗魚，虹鱒，大西洋鮭進化關系較近，處于一支，說明C型凝集素在進化過程中，草魚同硬骨魚的親緣關系較近，其中與斑馬魚的關系最近。

草魚凝集素基因的同源性分析。用DNAMAN對所選物種凝集素的CRD進行多序列比對發現，草魚凝集素CRD與斑馬魚凝集素CRD的相似度達到90%，同鯽魚、雀鱔、大西洋鮭和虹鱒的相似度分別達到83%、63%、53%和51%。序列比對結果進一步驗證了在草魚的CRD中存在6個保守的半胱氨酸（用箭頭標出）殘基和一個甘露糖結合位點EPN基序（用棱形標出），并且在這幾種硬骨魚凝集素的CRD中均存在WIGL序列。由此可以看出，草魚凝集素的CRD與斑馬魚的同源性最高。

討論

本研究用Trizol法從草魚組織中提取RNA，通過RT-PCR技術克隆獲得草魚凝集素基因的開放閱讀框的長度為795bp，編碼了一個由264個氨基酸殘基組成的蛋白質。生物信息學軟件分析發現，用SMART對該蛋白質的結構進行分析，發現草魚凝集素蛋白是由一個跨膜區（46～68aa）和一個CRD（125～256aa）組成，且CRD位于該蛋白的C端，含有六個保守的半胱氨酸殘基，由此可以判定草魚凝集素的CRD屬于標準長型CRD。從其序列分析來看，在草魚凝集素的CRD上存在一個WIGL基序和甘露糖結合位點即EPN基序，因此可以確定該凝集素是一種C型凝集素。同源性分析表明，草魚與斑馬魚的相似度最高，達到90%。從系統進化樹分析結果表明草魚凝集素與斑馬魚的親緣關系最近。可利用已獲得的草魚凝集素基因作為重組表達的基礎，用真核表達系統進行表達純化，研究其蛋白質的組成及功能，研發出新型的病害治療藥物，應用于草魚的免疫和病害防御上，實現健康、可持續的養殖。

作者簡介：

米亞雙（1991-），女，河南南陽人，河南師范大學在讀研究生。