豬沙門氏菌耐藥基因檢測方法應用分析

余超亞

摘要：沙門氏菌是一種重要的人畜共患病的病原菌，其分布廣，危害大。而隨著抗生素的廣泛應用，細菌的耐藥性也隨之出現，耐藥的水平越來越高，耐藥種類越來越多。本文則針對豬沙門氏菌病的流行現狀及危害，病原菌的耐藥現狀、耐藥機理、耐藥性的基因檢測方法、防范對策進行綜述。

關鍵詞：豬；沙門氏菌；耐藥機理；基因檢測

在抗菌藥物的不斷普及以及廣泛使用下，細菌逐漸呈現出耐藥性。特別對于畜牧養殖業來說，為對疾病感染做出避免，使動物健康成長，越來越多的飼養人員將抗生素作為飼料添加劑來進行使用，因劑量不足以及藥物殘留使得耐藥菌株大量出現。一直以來，各國學者針對細菌耐藥機理實施了詳細的探討，取得了一定的成績，尤其在分子生物學以及基因工程技術的不斷快速發展下，細菌耐藥機理實現了更深入的研究，本文則基于此對豬沙門氏菌耐藥基因檢測方法應用進行詳細的分析。

一、豬沙門氏菌病的流行現狀與危害

豬沙門氏菌會導致仔豬副傷寒，急性病例可能會引發敗血癥變化，有著極高的死亡率。慢性病例則可能會引發壞死性腸炎，對豬的正常生長造成不利影響。豬沙門氏菌極易引發2-4月齡仔豬副傷寒，屬于養殖業面臨的一大難題。急性敗血癥、慢性壞死性腸炎以及頑固性下痢等屬于仔豬副傷寒（簡稱仔副）的臨床癥狀，會導致大量的斷奶仔豬同時發病，在并發感染其它疾病以及未及時治療的情況下，有著極高的死亡率，使得養殖戶出現很大的損失。該病隨時有可能發生，通常都是和豬瘟同時出現，使得發病率以及死亡率出現了很大的增長。

二、病原菌的耐藥現狀及耐藥機理

（一）病原菌的耐藥現狀

馬越針對分離的沙門氏菌在耐藥性變化方面實施了詳細的研究探討，得知非傷寒沙門氏菌在兩年的時間里，對于臨床常用抗菌藥所具備的耐藥率持續上升，自20.0%增長到了31.5%，一直增長至50.0%-59.3%，在耐藥率方面出現了一倍左右的增長。基于國外相關調查能夠得知，非傷寒沙門菌以及大腸桿菌對于臨床常用抗菌藥存在一定的耐藥性，同時耐藥率還處于不斷增加的趨勢，可以對多種抗菌藥物產生耐藥性的菌株數量也不斷增加。通過CDC的資料能夠得知，對于耐氨節西林，氯霉素，鏈霉素，磺胺以及四環素的鼠傷寒沙門菌，其從1979年占據美國鼠傷寒沙門菌分離株比重的l%以下朝1996年占據34%的比重進行了增長。最近幾年，沙門氏菌多重耐藥菌株持續導致人和動物出現疾病，對于公眾健康有著極大的不利影響，使得世界各國對其做出了重視。

（二）病原菌的耐藥機理

1.細菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機理

當前，比較常見的氨基糖苷類抗生素耐藥機理主要包含有以下幾種：其一，細菌之所以對氨基糖苷類抗生素存在抗性主要是因為藥物無法在細菌胞內形成一定程度的濃度。細菌便是基于該機制而對慶大霉素存在耐藥性的。其二，處于核糖體結合位點的變化核糖體屬于氨基糖苷類抗生素的主要作用點，在核糖體蛋白以及16SrRNA出現突變的情況下，16SrRNA甲基化修飾等會使得細菌出現一定的耐藥性。其三，細菌之所以可以對氨基糖苷類抗生素做出抵抗主要是由于細菌可以對氨基糖苷類抗生素鈍化酶做出構成，該類酶共價對抗生素特定氨基以及氨基功能團起到修飾作用，抗生素以及核糖體氨酰-tRNA在被修飾之后，親和力便會出現很大程度的減少，無法對細菌蛋白質在合成方面做出有效阻止，使得細菌對抗生素出現抵抗能力。

2.細菌對四環素類抗生素的耐藥機理

通常情況下，四環素之所以存在耐藥性主要是因為具備和接合質粒以及轉座子相關的新四環素耐藥基因tet（又叫做四環素抗性決定子）。tet基因編碼胞質（漿）膜蛋白Tet（又叫做Tet逆向轉運蛋白），屬于質子動力依賴性蛋白的一種。Tet膜蛋白介導在耐藥機制方面主要涉及到以下幾個方面：能量依賴性泵出機制（又叫做主動轉運機制）、核糖體保護機制以及四環素鈍化酶機制。和核糖體保護機制存在關聯的耐藥基因主要包含有tet（M），tet（O），tet（S），tet（W），tet（Q），tet（T），otr（A）以及tetP（B）等這幾種。和酶鈍化機制存在關聯的耐藥基因主要包含有tetX編碼蛋白，其屬于氧化還原酶的一種，基于化學修飾四環素來讓四環素不再具備活性。

3.細菌對磺胺類抗生素的耐藥機理

當前，在革蘭氏陰性腸道菌中，已發現對磺胺類藥物存在抗性的兩種二氫葉酸合成酶，Sul I，Sul II以及Sul III分別為其基因命名。相比大腸桿菌以及其它細菌中所包含的二氫葉酸合成酶基因（dhps）來說，Sul I，Sul II在保守序列方面存在很大的不同。而對于Sul III，對其的研究和探討時間不長。2002年，Vincent等在對大腸桿菌的PV0440質粒進行研究的過程中，得知在質粒上存在一種功能和二氫葉酸合成酶十分相似的蛋白質，相當于263個氨基酸的大小。其表達基因Sul III可以讓大腸桿菌對磺胺類藥具備一定的抗性。

細菌之所以極易對磺胺類藥物出現耐藥性，主要是由于細菌中具備大量的PABA、二氫葉酸合成酶在結構上出現了更改以及對外源性葉酸進行了直接形式的使用。每種磺胺類藥相互之間都會出現交叉耐藥現象。

4.細菌對氯霉素類抗生素的耐藥機理

一般情況下，酶的滅活機制細菌之所以對氯霉素以及甲砜霉素存在抗性主要是因為乙酰基轉移酶對氯霉素以及甲砜霉素存在一定的鈍化作用。黃瑞等針對傷寒沙門氏菌在耐藥性方面實施了長期的研究，基于質粒的消除以及轉化試驗得知，該質粒是使得傷寒沙門氏菌具備耐藥性的關鍵因子。孫憲鋒以氯霉素乙酰轉移酶活性（CAT）以及藥敏試驗（MIC）為基礎，基于Slot blot以及Southern blot法對沙門菌耐藥基因在位置方面實施檢測，最終得知，大多數（10/16）傷寒菌耐氯霉素基因都存在于質粒上，還有一小部分（1/16）則存在于染色體（3/16）上。

三、耐藥性的基因檢測方法

（一）藥敏試驗

主要包含有兩種方面，分別為稀釋法以及擴散法。稀釋法主要是基于大腸桿菌ATCC25922以及沙門氏菌標準株C79213來充當作藥敏質控菌，通過對具備一定濃度的抗菌藥物以及含有被試豬沙門氏菌的培養基做出運用來完成倍數上存在差異的稀釋，通過一段時間的培養，對最低抑菌濃度（MIC）做出觀察；擴散法主要指的是將浸有抗菌藥物的紙片朝涂有豬沙門氏菌的瓊脂平板上進行粘貼，抗菌藥物不斷向周圍彌漫，濃度隨著時間的推移慢慢減少，所以敏感豬沙門氏菌通常在紙片距離內會難以實現快速增長，基于稀釋試驗所獲取的MIC對數和基于擴散試驗所獲取的抑菌直徑之間存在著一種直線關系。

（二）實時定量PCR檢測

這屬于對熒光染料做出使用來實現快速定量的一種檢測方法，該方法主要是對兩種經過特別設計的序列特異性寡核苷酸做出運用，基于熒光染料來對核苷酸進行標記，通過雜交之后，這2種熒光染料在定位上十分接近，以此來為能量轉移提供便利，這種情況被稱作為熒光共鳴能量轉移。第1種染料主要是由于受到光釋放二極管的影響，其能量會朝第2種染料上進行轉移。在此之后，第2種染料會對長波的紅色熒光做出相應的釋放。

（三）利用DNA芯片檢測

基因芯片技術主要包含有兩種模式：其一為將靶DNA朝支持物上進行固定，這種方法和同時進行大量不同靶DNA的分析之間較為符合，其二為將大量探針分子朝支持物上進行固定，這種方法和對同一靶DNA實施不同探針序列的分析之間較為符合。主要是對DNA芯片技術做出采用，以細菌23rRNA基因序列信息以及耐藥基因為基礎，來將其充當作檢靶基因，對基于豬沙門氏菌的寡核苷酸探針以及耐藥基因探針的基因芯片做出詳細的設計，以雜交反應為基礎，來對致病菌以及其耐藥基因做出最終檢測。

六、防止耐藥性產生的對策

基于以下方法對耐藥性進行控制，能夠使得耐藥菌株數量減少。具體為：

（一）加強藥政管理

對抗菌藥物在審批標準方面實施嚴格的管理，在對藥物進行審批的過程中需對其耐藥性以及所存在的隱性影響做出考量，對獸用抗菌藥和人用醫療藥物進行分開放置；對抗菌藥物在質量管理方面做出全面加強，盡量減少對抗菌藥物的使用；除此之外，針對監測細菌耐藥性的和機構做出專門的構建，以細菌耐藥的發展現狀及趨勢作為基礎，對抗菌藥做出計劃性的使用。

（二）規范用藥

減少通過抗生素來對豬沙門氏菌病進行預防的次數，以疫苗免疫機制為基礎對該病做出有效控制。在對豬沙門氏菌病實施治療的過程中，首先需采取藥敏試驗，避免用低敏藥物來實施治療。另外，要基于適應癥來對劑量以及療程做出確定，對由于劑量過大而導致的藥物浪費和毒性反應做出避免，避免因劑量不足而引發的病情延遷現象，減少慢性、復發以及耐藥性發生的幾率。

（三）新型抗菌藥物的研究

針對沙門氏菌耐藥性在獲取途徑以及耐藥性產生機理方面實施詳細的分析研究，對新的抗菌藥物做出持續的開發，對干預措施做出制定來對耐藥性的產生做出有效避免，從而對越來越嚴峻的沙門氏菌耐藥性問題做出有效防治。

結合以上所描述的，濫用抗生素屬于導致豬沙門氏菌具備耐藥性的主要影響因素，但耐藥基因的遺傳也屬于其中一個原因。根據相關資料得知，通常情況下，其耐藥性都是針對西藥的，而對于中藥則不明顯，由此能夠得知，在對豬沙門氏菌病做出治療時，需對中藥做出使用，若對西藥做出使用則需先進行藥敏試驗，通過高敏藥物來實施治療。

結論

豬沙門氏菌具備分布廣，危害大，傳播速度快以及耐藥性強等一系列特征，對于我國豬養殖業的發展造成了極大程度的影響。本文針對豬沙門氏菌的流行現狀與危害、耐藥機理以及耐藥性的基因檢測方法進行了詳細的分析探討，得出當前豬沙門氏菌具備極強耐藥性的結論，相關人員需盡快找到抑制豬沙門氏菌耐藥性的對策和方法。

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