高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的孔雀石綠

黎素菊+陳樹鵬+洪捷嫻+陳曉銜

摘 要：本文主要針對高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中的孔雀石綠展開了探討，通過結(jié)合具體的試驗實例，對材料與方法作了詳細的闡述，并對試驗結(jié)果作了分析，以期能為有關(guān)方面的需要提供參考借鑒。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；測定；水產(chǎn)品；孔雀石綠

孔雀石綠為三苯甲烷類工業(yè)染料， 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以有效的預防與治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小蟲病，并能保持水產(chǎn)品的新鮮度。但是若人體攝入孔雀石綠，將會對健康產(chǎn)生極為嚴重的危害。因此，對水產(chǎn)品必要要有嚴格的測定，以防止孔雀石綠對人體健康帶來不必要的影響。

一、材料與方法

1.試驗材料。試劑有乙腈（德國默克，色譜純）；孔雀石綠標準品（美國Sigma公司）；中性氧化鋁固相萃取柱（supelco公司，1g/3mL）；濾膜（上海安譜，0.45μm，有機相）。標準溶液：孔雀石綠標準品（0.1g，Sigma）；100μg/mL標準儲備液：稱取孔雀石綠標準品10mg（精確到0.1mg），用乙腈溶解并定容于100mL容量瓶中；1.0μg/mL標準中間液：吸取1.00mL標準儲備液于100mL容量瓶中，用流動相定容；標準工作液：分別移取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mL標準中間液分裝于100mL容量瓶中，用乙腈定容，制成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg/L標準系列濃度。

儀器有高效液相色譜儀（LC-20AB，島津），配有熒光檢測器；勻漿機（IKA，德國），漩渦混合器（IKA，德國）；離心機（Sigma3K30，德國）；超聲波清洗器（KQ-2200DB，昆山市超聲儀器公司）；固相萃取儀（MEDIWAX，美國）；多樣品自動濃縮儀（V-700，BUCHI）；超純水器（arium ? comfort I，sartorius）。

2.色譜分析條件。色譜柱：VarianPolarisC185μm4.6mm×250mm；流動相：乙腈：乙酸銨緩沖液（80：20，v/v）；流速1.0mL/min；柱溫30℃；激發(fā)波長265nm、發(fā)射波長360nm；進樣量20μL。

3.樣品的前處理。（1）提取。稱量5.00g（精確至0.01g）試樣于50mL離心管中，加入15mL乙腈，漩渦混合2min，10000r/min勻漿提取30s，6000r/min離心10min，取上清液至自動濃縮樣品瓶中。另取一支50mL離心管，加入15mL乙腈，清洗勻漿機刀頭，洗滌液轉(zhuǎn)移至前一離心管。用玻璃棒搗碎離心管中的樣品，漩渦混合2min，超聲波提取10min，6000r/min離心10min，上清液合并至自動濃縮樣品瓶中。（2）濃縮。將上清液放入多樣品自動濃縮儀，50℃下濃縮至近干，用5mL乙腈溶解殘渣。（3） 凈化。中性氧化鋁柱用5mL乙腈活化，樣液過柱，用自動濃縮樣品瓶收集流出液，5mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，合并流出液。（4）濃縮。將上清液放入多樣品自動濃縮儀，50℃下濃縮至近干，乙腈定容至1mL，渦旋混勻，用0.45μm濾膜過濾，按照1.2的方法上機測定。

二、結(jié)果與分析

1.提取液的選擇。標準中選擇乙腈及乙酸鹽緩沖液提取，同時加入鹽酸羥胺和對甲苯磺酸，雖然提取效果很好，但是試驗表明，僅用乙腈提取，回收率也較高。該法將提取液進行簡化，減少了試劑的浪費，提高了提取效率。

2.提取方式的選擇。應(yīng)用《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定（GB/T19857-2005）》，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法僅用勻漿機來提取。但試驗中發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)品僅用勻漿機提取，其回收率較差。反復試驗發(fā)現(xiàn)，用漩渦混合、超聲波及勻漿機提取的效果好，回收率較高。

3.色譜條件的選擇

（1）色譜柱的選擇。基于流動相的調(diào)整上，用C18作為分離色譜柱，因其具有理想的峰形、分離度、目標峰保留時間，且應(yīng)用廣泛。

（2）流動相的選擇。反復將乙腈和乙酸銨緩沖液的配比進行試驗，發(fā)現(xiàn)乙腈體積分數(shù)為80%時，峰形較好，保留時間適中，且分離度理想，目標峰在11.2min出峰，雜峰都可以在15min以內(nèi)流出（圖1、2）。

4.標準曲線相關(guān)性、線性范圍及檢出限。孔雀石綠工作液濃度在1.0～50.0μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。以峰面積（Y）為縱軸，工作液濃度（X）為橫軸，得到良好的線性關(guān)系，建立回歸方程為Y=37190X+10109，r2=0.9997。按3倍信噪比計算，得出方法檢出限為1.0μg/kg。

5.方法的準確度。選擇鯽魚、草魚、河蝦空白樣品各1個，每個樣品稱取3份，分別準確加入1.0μg/mL標準中間液0.1mL，測定相關(guān)數(shù)據(jù)。上述水產(chǎn)品的平均加標回收率、相對標準偏差分別為89.0%～96.5%、2.0%～2.2%（表1）。

三、結(jié)論

通過試驗，建立了高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠的分析方法。結(jié)果表明，選擇乙腈為提取液，采用漩渦混合、超聲波及勻漿機提取方式，C18柱作分離色譜柱，乙腈體積分數(shù)為80%時，分離效果較好，孔雀石綠檢出限為1.0μg/L，加標回收率及相對標準偏差分別為89.0%～96.5%、2.0%～2.2%。

四、結(jié)語

綜上所述，人體攝入孔雀石綠，將會對健康產(chǎn)生極為嚴重的危害。因此，對其進行測定非常必要，而在高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠的試驗中，此方法能科學準確的得出孔雀石綠的含量，值得應(yīng)用推廣。

參考文獻：

[1]區(qū)敏霞.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱性孔雀石綠殘留量的方法優(yōu)化探討[J].科學中國人.2015（01）.

[2]周蓉、趙國輝、沙雪、王世君.用高效液相色譜儀測定水產(chǎn)品中孔雀石綠方法研究[J].科技致富向?qū)?2012（07）.

[3]陳永平、張素青、李春青、林黎明.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量方法的改進[J].動物醫(yī)學進展.2011（11）.