香水百合總黃酮提取液體外抑菌活性研究

杜娟+鄒園+羅秋水

摘要：建立了香水百合（Lilium casa blanca）中總黃酮提取液體外抑菌活性的測(cè)定方法。以70%乙醇水溶液提取香水百合中的總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用分光光度法測(cè)定其總黃酮含量。以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌為供試菌，采用濾紙片法和最低抑菌濃度法（MIC）測(cè)定了提取液的體外抑菌活性。結(jié)果表明，香水百合中總黃酮含量為137 mg/g（13.7%）；總黃酮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.25 mm，對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈平均直徑為9.75 mm；最低抑菌濃度分別為0.587 5 mg/mL（金黃色葡萄球菌）和2.350 0 mg/mL（大腸埃希氏菌）。香水百合總黃酮提取液具有一定的抑菌活性，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果比大腸埃希氏菌好。

關(guān)鍵詞：香水百合（Lilium casa blanca）；總黃酮；抑菌活性

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）14-2743-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.036

Abstract：Determination on the vitro antibacterial activity of total flavonoids from Lilium casa blanca was established. Total flavonoids were extracted by 70% ethanol water solution，and its contents were measured by spectrophotometric method using rutin as the standard regents. Antibacterial activity was measured by filter paper method and minimum inhibitory concentration （MIC） measurement method. Results showed that the concentration of total flavonoids in Lilium casa blanca was 137 mg/g （13.7%）；the average diameter of inhibition zone was 13.25 mm for Staphylococcus aureus and 9.75 mm for Escherichia coli； the minimum inhibitory concentration was 0.587 5 mg/mL for Staphylococcus aureus and 2.350 0 mg/mL for Escherichia coli. Total flavonoids from Lilium casa blanca showed better antibacterial activity on Staphylococcus aureus than on Escherichia coli.

Key words：Lilium casa blanca； toal flavonoids； antibacterial activity

黃酮類化合物是植物在長(zhǎng)期自然選擇過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。近年來許多研究已表明黃酮類化合物具有多種生物活性，在抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面均具有顯著效果[1]。香水百合（Lilium casa blanca）是一種多年生鱗莖類球根草本植物，主要用于觀賞[2]。目前對(duì)于香水百合的研究多集中于其揮發(fā)性成分[3]，對(duì)其他成分研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)利用乙醇水溶液提取香水百合中的黃酮類化合物，通過抑菌圈法和最低抑菌濃度法（MIC）分別研究了總黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌活性，得到相應(yīng)的抑菌圈直徑和最低抑菌濃度。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究香水百合的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香水百合購(gòu)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)商業(yè)街；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）購(gòu)于上海北諾生物科技有限公司；其余試劑均為市售生化試劑或國(guó)產(chǎn)分析純；粉碎機(jī)、水浴鍋、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮的提取 總黃酮的提取：準(zhǔn)確稱取 0.5 g干燥后的香水百合粉末，以70%乙醇水溶液為提取劑，料液比為1∶30（g/mL，下同），在50 ℃下水浴提取1.5 h，過濾，提取液以70%乙醇定容至100 mL。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 總黃酮含量的測(cè)定采用硝酸鋁顯色法[4]，以蘆丁為對(duì)照品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取205 mg干燥至恒重的蘆丁粉末，用70%甲醇溶解得蘆丁儲(chǔ)備液，使用時(shí)用70%甲醇稀釋至0.205 mg/mL，為蘆丁稀釋液。準(zhǔn)確移取蘆丁稀釋液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別放置于50 mL容量瓶中，加入70%的乙醇溶液至6 mL，再分別加入5%亞硝酸鈉各2 mL，振蕩均勻，放置6 min，然后加入10%氯化鋁1 mL，振蕩均勻，放置6 min，最后加4%的氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻，用水定容至刻度線，放置15 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取液總黃酮含量的測(cè)定：從100 mL提取液中用移液管移取1.5 mL總黃酮提取液至50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至6 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行測(cè)定，求得提取液中黃酮的含量。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) ①試劑配制。培養(yǎng)基的制作：分別稱取蛋白胨1.0 g、牛肉膏0.3 g、氯化鈉0.5 g和瓊脂1.5～2.0 g，蒸餾水溶解至100 mL，pH調(diào)至7.2～7.4，即得固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基除不加瓊脂外，制作方法與固體培養(yǎng)基相同。菌種的活化：分別將金黃色葡萄球菌菌株和大腸埃希氏菌菌種接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基斜面，37 ℃過夜培養(yǎng)。菌懸液的制備：在2個(gè)裝有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中各接種一環(huán)活化后供試菌株，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，制得初始菌懸液。用無菌生理鹽水采用梯度稀釋法將初始菌懸液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等6個(gè)濃度梯度的菌懸液；選取10-5、10-6兩個(gè)濃度梯度菌懸液各取200 μL分別涂布平板，并作平行試驗(yàn)，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)18 h后計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用無菌生理鹽水稀釋成合適濃度的菌懸液作為供試菌懸液。②抑菌圈法。每個(gè)平皿倒入約20 mL滅菌牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制成平板，待培養(yǎng)基凝固后，分別加入2種菌懸液（金黃色葡萄球菌：1.3×107 CFU/mL，大腸埃希氏菌7.75×106 CFU/mL）各200 μL，用無菌涂布器涂布均勻。用鑷子夾取直徑為6 mm已經(jīng)浸取總黃酮提取液的濾紙片，在平板壁上貼合濾紙片至樣品不滴落，然后貼于含菌平板上。每個(gè)樣品平行做兩皿，并以浸取生理鹽水的濾紙片作為空白對(duì)照，37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h后，分別測(cè)量各樣品的抑菌圈直徑（mm）。③最低抑菌濃度法。將總黃酮提取液（C=4.7 mg/mL）用2倍稀釋法進(jìn)行稀釋，然后按照培養(yǎng)基-粗提液（4∶1，V/V）的比例混勻擺斜面，分別得到總黃酮含量為2.350 0、1.175 0、0.587 5、0.293 8 mg/mL的斜面培養(yǎng)基。用移液槍點(diǎn)種供試菌懸液10 μL，待菌懸液干后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物質(zhì)量濃度為總黃酮提取液對(duì)檢測(cè)菌的最低抑菌濃度（MIC）。每個(gè)受試樣平行重復(fù)2次，以不含樣品的斜面培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 香水百合中總黃酮的含量

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為A=0.011C-0.001 1（R2=0.999 7）。將提取液測(cè)得吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中即求得提取液中總黃酮含量為137 mg/g，即樣品中總黃酮含量為13.7%。

2.2 抑菌活性

2.2.1 抑菌圈法試驗(yàn)結(jié)果 抑菌圈法是通過在涂有菌懸液的固體培養(yǎng)基上貼上浸取試樣的圓形濾紙片，濾紙片上的試樣會(huì)抑制濾紙片周圍的菌形成抑菌圈，抑菌圈直徑大于6 mm為有抑菌作用，抑菌圈直徑越大說明抑菌活性越強(qiáng)[5]。由圖1可知，（a）和（b）分別是總黃酮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌結(jié)果。經(jīng)測(cè)量可得，香水百合總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.25 mm，對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈平均直徑為9.75 mm。結(jié)果表明，香水百合中總黃酮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌均有一定的抑制作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸埃希氏菌。牛立新等[6]研究了3種食用百合鱗莖提取物對(duì)4種細(xì)菌抑菌作用，結(jié)果表明3種食用百合鱗莖提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用均強(qiáng)于對(duì)大腸埃希氏菌的抑制作用，與本試驗(yàn)得到的結(jié)果相一致。

2.2.2 MIC法試驗(yàn)結(jié)果 最低抑菌濃度法是將試樣與培養(yǎng)基通過2、4、8、16倍稀釋，稀釋成不同濃度的培養(yǎng)基，將菌懸液點(diǎn)接于培養(yǎng)基上，觀察菌是否生長(zhǎng)，在2個(gè)菌長(zhǎng)與不長(zhǎng)的相鄰濃度中，菌生長(zhǎng)的濃度為最低抑菌濃度[7]。由表1可知，香水百合總黃酮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為0.587 5 mg/mL和2.350 0 mg/mL。劉芳等[8]對(duì)當(dāng)歸總黃酮醇提取液的體外抑菌活性進(jìn)行了研究，得到其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.5 mg/mL，對(duì)大腸埃希氏菌的MIC為1 mg/mL。結(jié)果表明，香水百合總黃酮醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用與當(dāng)歸相近，但對(duì)大腸埃希氏菌的抑制作用稍弱。

3 小結(jié)與討論

本研究以70%乙醇水溶液提取香水百合中的總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用分光光度法測(cè)定其總黃酮含量。以金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌為供試菌，采用濾紙片法和最低抑菌濃度法測(cè)定了提取液的體外抑菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，香水百合中總黃酮的含量為137 mg/g（13.7%）；總黃酮提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.25 mm，對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈平均直徑為9.75 mm；最低抑菌濃度分別為0.587 5 mg/mL（金黃色葡萄球菌）和2.350 0 mg/mL（大腸埃希氏菌）。試驗(yàn)結(jié)果表明，香水百合總黃酮提取液具有一定的抑菌活性，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果比大腸埃希氏菌好。

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