盤龍七片對膝骨性關節炎患者療效與外周血Th17細胞及相關細胞因子的關系

李凌漢+何虹+林勇

[摘要] 目的 探討膝骨性關節炎患者不同中醫證型患者外周血Th17細胞和相關的細胞因子（IL-17、IL-1β和IL-6）的水平與盤龍七片療效的關系。 方法 選取淤血阻滯、陽虛寒凝、腎虛髓空三種中醫證型患者各25、24和26例，正常對照組24例，患者采用盤龍七片治療，每日3次，每次3片，治療前和治療6周后，留取正常對照組和患者外周血，采用流式細胞術和ELIS法檢測Th17細胞和血清細胞因子IL-17、IL-1β和IL-6濃度，并進行療效評估。 結果 腎虛髓空、陽虛寒凝、瘀血阻滯三種中醫證型患者Th17細胞比例和細胞因子濃度均高于正常對照組，且呈現逐漸增高的趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）；三種中醫證型有效治療者，Th17細胞比例和細胞因子濃度顯著降低，差異有統計學有統計學意義（P<0.05）；三種中醫證型患者療效呈現增高的趨勢，腎虛髓空型高于另外兩種證型，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 膝骨性關節炎患者外周血Th17細胞比例和細胞因子IL-17、IL-1和IL-6濃度與盤龍七片的療效有關，可作為中醫證型和預后的參考指標。

[關鍵詞] 骨關節炎，膝；Th17細胞；白細胞介素-6；IL-1β；盤龍七片

[中圖分類號] R593.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）13-09-04

[Abstract] Objective To explore the levels of peripheral blood Th17 cells and related cytokines including IL-17，IL-1βand IL-6 for different Traditional Chinese Medicine（TCM）Syndromes of patients with knee osteoarthritis and the relationship between Panlong Seven effect. Methods Knee osteoarthritis patients were divided into symptoms as blood stasis type （n=25），Yang deficiency cold coagulation type （n=24），kidney deficiency type（n=26） three groups.24 healthy persons served as control.All patients were administrated with Panlong Seven tablets，3 times a day，3 tablets each time.Before treatment and 6 weeks after treatment，peripheral blood in normal control group and all patients were collected.Flow cytometry and ELISA were used to detect the Th17 cells and theconcentrations of IL-17，IL-1β and IL-6 in serum，meanwhile to evaluate the therapeutic effect of Panlong Seven. Results The levels of Th17 cells and related cytokines in three TCM syndrome types patients of kidney deficiency type，Yang deficiency cold coagulation，blood stasis were higher compared with the normal control group.There were statistically significant difference（P<0.05）.The levels of them showed a gradually increasing trend.The percentage of Th17 cells and the concentration of cytokines were significantly decreased in effective patients in three TCM syndroms.There were statistically significant difference（P<0.05）.The curative effect showed gradually increasing trend.kidney deficiency type were higher than other two types，and there were statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion The effect of Panlong Seven is related to the levels of Th17 cells and cytokines IL-17，IL-1β and IL-6 in peripheral blood of patients with knee osteoarthritis，and they can be used as reference for TCM syndrome and prognosis.

[Key words] Knee osteoarthritis；Th17 cell；Interleukin-6；Interleukin-1β；Panlong seven

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）是全球范圍內的常見病、多發病之一，國內研究數據統計表明，55歲以上人群X線顯示有OA表現者約60%。隨著人口老齡化，發病率在全球范圍內呈現出一種逐年上升的趨勢。目前尚沒有一種根治方法。疼痛和發病的機制與關節滑膜細胞分泌過多的IL-1、IL-6、前列腺素E1并釋放入血液有關，關節液中玻璃酸鈉的分子量、濃度均降低導致骨關節發炎[1-2]。臨床上辯證分型有肝腎虧虛、精血虧虛、瘀血阻滯三種。治則：滋補肝腎、補氣活血、化瘀止痛。盤龍七片在治療膝關節骨性關節炎和類風濕性關節炎臨床實踐中已經初步顯示出較好的療效和減少副作用[3-6]。本研究就盤龍七片對膝骨性關節炎三種不同的中證型的療效及其與外周血Th17細胞及其相關細胞因子關系進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

KOA患者共75例，為2013年1月～2014年12月在廣州市第一人民醫院中醫科住院或者門診的患者，正常對照組為體檢健康者。KOA診斷標準參考中華醫學會骨科學分會《骨關節炎診治指南（2007年版）》[7]。患者納入標準：（1）化膿性膝關節炎的患者；（2）并發病影響到關節者，如骨腫瘤、骨結核或有明顯急性外傷史而造成半月板損傷、韌帶斷裂及血管神經損傷者；（3）膝關節局部有軟組織感染者；（4）妊娠或哺乳期婦女，伴有精神病，嚴重心、肺、腎及內分泌系統疾病的患者。中醫診斷標準參照《中西醫結合骨傷科學》[8]，KOA分3型：①淤血阻滯；②陽虛寒凝；③腎虛隨虧。我們按照上述分型進行分組。KOA的一般臨床資料，包括三種中醫證型性別、年齡、病程、膝關節病變的部位，以及正常對照組資料，見表1。三組和正常對照的性別和年齡上有可比性，KOA三種中醫證型的病程和膝關節病變部位有可比性，見表1。治療方案：予以口服盤龍七片（陜西盤龍制藥有限公司），每次3片，每日3次，飯后溫開水送服。治療后6周進行療效評估和抽取外周血進行細胞因子和Th17細胞檢測。

1.2 療效評定

療效標準療效判定標準參照《中藥新藥的臨床研究指導原則》，療效判定為治愈、顯效、有效和無效，總有效率=（治愈+顯效+有效）/總例數×100%[9]。

1.3 Th17細胞和細胞因子的檢測

1.3.1 外周血標本采集 正常對照組和患者在治療前、治療后6周空腹分別采集外周靜脈血標本5Ml，Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離出單個核細胞（MNC）和血清，血清-30℃冰箱保存。

1.3.2 流式細胞術檢測Th17細胞 外周血Th17細胞的流式細胞術的檢測方法參照我們的既往檢測方法和試劑盒說明[10]。

1.3.3 ELISA法檢測IL-17、IL-1β、IL-6濃度 血清IL-17、IL-1β、IL-6 濃度的檢測按ELISA 試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法

本研究數據采用SPSS16.2統計軟件，計量資料以（）表示，采用t檢驗；多組間均值比較采用單因素方差分析，若方差齊總體均值比較采用F檢驗，組間均值兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，若方差不齊，總體均值比較采用welch檢驗，組間均值兩兩比較采用Dunnetts t3檢驗；治療前后的比較采用配對t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種中醫證型患者與正常對照組外周血Th17細胞及細胞因子水平比較

三種中醫證型KOA患者在治療前，外周血Th17細胞比例、細胞因子濃度，三種證型均高于正常對照組（ΔP<0.05），淤血阻滯和陽虛寒冷凝組高于腎虛髓空組（#P<0.05），淤血阻滯組高于陽虛寒冷凝組（*P<0.05）。Th17細胞：腎虛髓空組、陽虛寒冷凝組、陽虛寒冷凝組與對照組比較， q=3.77、3. 89和3.93；陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.70、3.88；淤血阻滯組與陽虛寒冷凝組比較，q=3.71；IL-17：腎虛髓空組、陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與對照組比較，q=4.31、4.62、4.73；陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.72、4.18；淤血阻滯組與陽虛寒冷凝組比較，q=3.78；IL-1β：腎虛髓空組、陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與對照組比較，q=3.77、3.82、3.88；陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.75、3.88；淤血阻滯組與陽虛寒冷凝組比較，q=4.97；IL-6：腎虛髓空組、陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與對照組比較，q=3.79、3.84、4.18；陽虛寒冷凝組、淤血阻滯組與腎虛髓空組比較，q=3.74、3.83；淤血阻滯組與陽虛寒冷凝組比較，q=3.77。見表2。

2.2 三種中醫證型患者治療前后比較

盤龍七片對3種中醫證型患者之間的總的療效有統計學差異（χ2=6.03，P<0.05），有效率呈現逐漸增高的趨勢；有效治療者外周血Th17細胞比例、細胞因子濃度顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05），而IL-1β在三組的有效治療前后無統計學意義（P>0.05）。見表3。由于無效者例數少，未做治療前后比較。

2.3 三種中醫證型療效比較見表4。

3 討論

膝關節骨關節炎是引起中老年人膝關節疼痛的主要原因，本研究選擇年齡45歲以上的患者入組。中醫學認為本病屬“骨痹”范疇，臨床上辯證分型有三種[8]。近年來發現免疫因素在炎癥發生發展中起到重要作用，并發現有許多中成藥包括盤龍七片在治療膝關節骨關節炎方面有獨到之處。本研究發現，三種證型的患者外周血Th17細胞比例，IL-1β、IL-6和IL-17濃度均高于正常對照組；盤龍七片治療三種證型有效者，Th17細胞比例、IL-1β、IL-6和IL-17濃度均顯著降低，表明治療有效者通過抑制了Th17細胞的分化，減少Th17細胞分泌IL-17有關。

KOA的治療原則為：滋補肝腎、補氣活血、化瘀止痛，在臨床實踐中盤龍七片不失為治療骨痹的有效藥物，且與其降低患者外周血中IL-6和IL-17和IL-1β水平有關[3]。

眾所周知，IL-1β和IL-6及TNF-α與Th17細胞的分化發育和釋放的細胞因子密切相關，且Th1和Th17細胞通常在細胞免疫中相互作用，相互制約。最近研究表明Th17細胞在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中起到一定作用[11]，透明質酸鈉注射液聯合塞來昔布膠囊降低膝骨關節炎患者血清IL-1β、TNF-α水平，與臨床療效相關[12]。本研究的盤龍欺騙對Th17細胞及細胞因子的作用，更加說明了膝關節骨關節炎的發展與炎癥反應有關。

RA和OA是滑膜炎為特征的慢性炎癥性疾病，人類滑膜組織中存在大量纖維母細胞樣滑膜細胞（ FLS），而在慢性關節炎的致病作用中起到主要的作用，FLS被TLR配體、炎癥因子，協調作用激活FLS，導致FLS損害關節的作用[13]。本組研究發現三組患者外周血中IL-6和IL-1β、IL-17高于正常對照組。KOA患者主要是IL-6、IL-1β濃度的增加促進Th17細胞的分化，而Th17細胞分泌特征性的細胞因子IL-17進一步加重KOA發展。而對于中醫三種證型患者IL-17濃度有顯著性差異，表明IL-17在不同證型中的作用不同 [14]。我們在此基礎上進一步研究，發現與此相對應的三種證型的患者外周血Th17細胞的差異與IL-17差異相一致，治療有效者，Th17細胞比例、細胞因子濃度顯著降低，有可能作為預后的指標之一。

本研究表明，外周血Th17、血清細胞因子含量在KOA各型中不同，瘀血阻滯型最高，陽虛寒凝型次之，腎虛髓空型最低，各型之間存在顯著性差異，說明腎虛髓虧型KOA多發生在早期階段，病情較輕；陽虛寒凝型KOA多發生在中期階段，病情相對較重；血瘀阻滯型則多發生在晚期階段，病情程度嚴重[15]。在盤龍七片治療中，發現淤血阻滯、陽虛寒冷凝和腎虛髓空型的總有效率呈現逐漸上升的趨勢，且腎虛髓空型的療效顯著高于其他兩組，這可能與三種證型處于疾病發展不同階段有關，在臨床上提升若患者處于較晚期階段可以采用聯合用藥或物理治療等綜合治療，可望提高療效[5]。

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（收稿日期：2017-05-09）