miR-10a在胰腺癌侵襲轉移中的作用

謝榮臻，曾祥福，鄧 偉，劉曉平，章新華

·論 著·

miR-10a在胰腺癌侵襲轉移中的作用

謝榮臻，曾祥福，鄧 偉，劉曉平，章新華

目的 探討microRNA-10a(miR-10a)在胰腺癌侵襲轉移中的作用。 方法 選取2014年1月至2016年12月在贛南醫學院第一附屬醫院切除的胰腺癌組織標本68例，同時選取癌旁組織作為對照，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測組織標本miR-10a表達；同時選取胰腺癌細胞株Capan-1細胞，以脂質體轉染法將miR-10a重組正、反義真核表達質粒載體轉染Capan-1細胞，采用RT-PCR檢測轉染細胞miR-10a表達，Transwell和Matrigel試驗觀察轉染細胞的遷移和侵襲能力，四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖能力。 結果 胰腺癌組織miR-10a相對表達量為(0.213±0.024)，明顯高于癌旁組織(P<0.01)；中低分化胰腺癌miR-10a相對表達量為(0.212±0.011)，明顯高于高分化胰腺癌(P<0.01)；有淋巴結轉移胰腺癌miR-10a相對表達量為(0.217±0.017)，明顯高于無淋巴結轉移胰腺癌(P<0.05)；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期胰腺癌miR-10a相對表達量為(0.230±0.015)，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期胰腺癌(P<0.01)。轉染48 h后，正義組miR-10a相對表達量為(0.021±0.010)，明顯高于反義組、空載組和空白對照組(P<0.05)；反義組miR-10a相對表達量為(0.003±0.001)，明顯低于空載組和空白對照組(P<0.05)。正義組24 h和48 h 光密度(OD)值分別為(0.602±0.018)和(0.753±0.041)，明顯高于反義組、空載組和空白對照組(P<0.05)；反義組24 h和48 h OD值分別為(0.451±0.023)和(0.591±0.038)，明顯低于空載組和空白對照組(P<0.05)。正義組遷移和侵襲細胞數分別為(85.22±12.10)個和(140.24±30.54)個，明顯高于反義組、空載組和空白對照組(P<0.05)；反義組遷移和侵襲細胞數分別為(12.52±3.22)個和(20.41±8.66)個，明顯低于空載組和空白對照組(P<0.05)。 結論 miR-10a過表達可對胰腺癌有生長促進、增強侵襲和遷移的作用，值得進一步研究。

miR-10a；胰腺癌；侵襲；遷移；臨床病理特征；轉染

胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤，也是目前最為致命的惡性腫瘤之一，患者的預后極差，但其具體發病機制目前尚不完全清楚[1-2]。目前臨床上多采用手術切除和化療的方式治療胰腺癌患者，但效果并不明顯，而造成患者預后較差的主要原因是胰腺癌細胞的高度侵襲轉移特性[3-4]。胰腺癌侵襲轉移的分子機制尚不完全清楚，而研究探討胰腺癌的高度侵襲轉移特性并尋找可抑制胰腺癌侵襲轉移的特異性分子靶向治療方法對于提高治療的效果具有重要的意義。近年來研究發現[5-6]，微小RNA(miRNA)可能在基因表達調控領域中起著超乎想象的重要作用，而多種miRNAs 在腫瘤的發生、發展和轉移過程中均發揮著重要的作用。為了進一步探討miR-10a在胰腺癌侵襲轉移中的作用，本研究對胰腺癌組織標本和癌旁組織的miR-10a表達水平進行了檢測分析，并觀察分析了轉染miR-10a重組正、反義真核表達質粒載體后對胰腺癌細胞遷移、侵襲、增殖能力的影響，旨在為臨床上提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本 選取2014年1月至2016年12月在我院切除的胰腺癌組織標本68例，其中男42例，女26例；年齡40～71歲，平均年齡(61.01±5.67)歲。納入標準：①均經病理學確診；②患者臨床病理資料保存完整；③術前未行放化療等資料。排除標準：①合并有其他原發性腫瘤；②臨床病理資料不完整。同時選取同一病例癌旁組織(距癌組織邊緣>1.5 cm)作為對照。

1.2 胰腺癌細胞系 人胰腺癌細胞株Canpan-1購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器與試劑 Beckman Microfuge高速冷凍離心機(美國)，PCR儀(Gene Amp PCR system2400，美國)，分子定量成像系統(Gel Doc 1000UV BIO-RAD公司，美國)，二氧化碳培養箱(Napco-5410，美國)，倒置相差顯微鏡、攝像設備(Olympus IX70PM-30，日本)及圖像分析儀；880型酶標儀(德國)。Trizol提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國Epitomics公司；胎牛血清、RMPI1640完全培養基均購自美國sigma公司；正義、反義miRNA-10a質粒載體及空載均購自上海吉瑪生物制藥有限公司；脂質體(Lipofectamine)2000購自Invitrogen 公司。CCK-8 試劑盒購自碧云天試劑公司；侵襲(Transwell)小室購自美國coring 公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國BioSharp公司。

1.3.2 細胞傳代培養 Canpan-1細胞株采用含10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM液體培養基,在5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中進行培養，待細胞密度達到約80%時進行傳代培養, 取指數生長期細胞進行實驗。

1.3.3 脂質體轉染法 采用脂質體瞬時轉染法進行轉染，具體方法如下：將傳代培養的Canpan-1細胞株接種于6孔培養板中，加入含5%胎牛血清的RMPI1640完全培養基進行培養，待貼壁細胞生長至60%～70%融合時利用pPG-CMV-EGFPmiR-10b 重組正、反義真核表達質粒載體進行轉染，并分為4組：正義組(pPG-CMV-EGFPmiR-10b 重組正義真核表達質粒載體轉染)、反義組(pPG-CMV-EGFPmiR-10b 重組反義真核表達質粒載體轉染)、空載組(空載體pPG-CMV-EGFP 轉染)和空白對照組(未轉染)，具體步驟嚴格按照說明書進行操作，轉染結束后加培養基增殖培養48 h。

1.3.4 MTT檢測 分別于轉染48 h后取各組細胞懸液利用胰蛋白酶進行消化，加入含10%胎牛血清的RMPI1640完全培養基進行培養，并于培養0 h、24 h和48 h時取各組細胞懸液加入MTT (5 mg/mL)孵育4 h，隨后加入二甲基亞砜(DMSO)進行溶解并沉淀，利用酶標儀在490 nm波長測定各孔的光密度(OD)值，觀察各組細胞增殖情況，每組實驗重復3次。

1.3.5 Transwell細胞侵襲及遷移檢測 先以無血清培養基在37 ℃條件潤濕Transwel小室2 h，將轉染48 h的細胞用胰酶消化后計數，選取1×106個細胞以無血清的RPMI-1640培養液進行重懸并接種于上室，下室中僅加入10%的完全培養基，于37 ℃、5%CO2條件下培養48 h。取出濾膜后以10%多聚甲醛固定，蘇木紅染色后光鏡下觀察，計數穿膜細胞數，取其均值代表遷移力量值。

1.3.6 實時定量PCR檢測(RT-PCR) 取各組轉染后培養48 h細胞，利用Trizol提取試劑盒提取總RNA，利用逆轉錄試劑盒逆轉錄為DNA，在聚合酶的作用下進行擴增，引物如下：上游：ACATCATACCCTGTAGAACCGAA；下游：GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC。擴增條件如下：95 ℃、5 min后，以95 ℃、15 s進行變性，60 ℃、60 s進行退火，72 ℃、5 min30 s進行延伸，此為1個循環，共進行40個循環，電泳后進行實時定量PCR測定，最終得出miR-10a的表達水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

取胰腺癌組織標本和癌旁組織各100 mg，采用RT-PCR法定量檢測miR-10a水平，方法同轉染細胞的檢測方法。

2 結 果

2.1 miR-10a在胰腺癌組織中的表達 胰腺癌組織miR-10a相對表達量為(0.213±0.024)，明顯高于癌旁組織(0.013±0.010)，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 miR-10a與胰腺癌臨床病理特征關系 miR-10a相對表達量與胰腺癌病理分級、淋巴結轉移和TNM分期有關，中低分化胰腺癌miR-10a相對表達量明顯高于高分化胰腺癌(P<0.01)，有淋巴結轉移胰腺癌miR-10a相對表達量明顯高于無淋巴結轉移胰腺癌(P<0.05)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期胰腺癌miR-10a相對表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期胰腺癌(P<0.01)。見表1。

2.3 轉染后miR-10a表達水平 轉染48 h后，正義組miR-10a相對表達量明顯高于反義組、空載組和空白對照組(P<0.05)；反義組miR-10a相對表達量明顯低于空載組和空白對照組(P<0.05)。見表2。

2.4 各組增殖情況 正義組24 h和48 h OD值明顯高于反義組、空載組和空白對照組(P<0.05)；反義組24 h和48 h OD值明顯低于空載組和空白對照組(P<0.05)。見表3。

臨床病理特征nmiR?10a相對表達量t值P值性別 男420 213±0 0130 0001 000 女260 213±0 011年齡 ≤60歲350 214±0 0180 4960 621 >60歲330 212±0 015腫瘤部位 頭頸部490 213±0 0170 6630 509 體尾部190 210±0 016腫瘤大小 ≤5cm500 215±0 0190 9440 348 >5cm180 210±0 020病理分級 高分化370 203±0 014-2 9050 008 中低分化310 212±0 011淋巴結轉移 有360 217±0 0172 1590 036 無320 209±0 013TNM分期 Ⅰ～Ⅱ400 201±0 016-7 5450 001 Ⅲ～Ⅳ280 230±0 015

組別miR?10a相對表達量F值P值正義組0 021±0 010反義組0 003±0 001?25 106<0 001空載組0 010±0 003?#空白對照組0 009±0 001?#與正義組比較，?P<0 05；與反義組比較，#P<0 05

組別OD值0h24h48h正義組0 418±0 0180 602±0 018?#△0 753±0 041?#△反義組0 416±0 0130 451±0 023?#0 591±0 038?#空載組0 417±0 0170 537±0 0240 681±0 040空白對照組0 416±0 0120 536±0 0210 684±0 037F值2 10618 16620 173P值0 892<0 001<0 001與空白對照組比較，?P<0 05；與空載組比較，#P<0 05；與反義組比較，△P<0 05

2.5 各組細胞遷移和侵襲比較 正義組遷移和侵襲細胞數明顯高于反義組、空載組和空白對照組(P<0.05)；反義組遷移和侵襲細胞數明顯低于空載組和空白對照組(P<0.05)。見表4 和圖1、圖2。

組別遷移情況侵襲情況正義組85 22±12 10?#△140 24±30 54?#△反義組12 52±3 22?#20 41±8 66?#空載組45 56±9 8468 43±9 11空白對照組44 47±8 2370 23±10 41F值57 89460 136P值<0 05<0 05與空白對照組比較，?P<0 05；與空載組比較，#P<0 05；與反義組比較，△P<0 05

a：空白對照組；b：空載組；c：反義組；d：正義組

圖1 各組Transwell細胞遷移圖

a：空白對照組；b：空載組；C：反義組；d：正義組

圖2 各組Transwell細胞侵襲圖

3 討 論

胰腺癌是一種惡性程度很高、診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90%為起源于腺管上皮的導管腺癌，其發病率和死亡率均較高，且近些年正在逐年上升，嚴重威脅著人類的生命健康[7-8]。胰腺癌的病因尚不完全清楚，其發生可能與吸煙、飲酒、高脂肪和高蛋白飲食、過量飲用咖啡、環境污染以及遺傳因素有關，患者的癥狀多為腹痛、黃疸、消瘦、乏力、腹部包塊等[9-10]。胰腺癌是預后最差的惡性腫瘤之一，其早期的確診率不高，而手術的死亡率較高，治愈率非常低[11]。研究表明[12]，胰腺癌患者預后較差的主要原因是其容易侵襲和轉移，進而導致胰腺癌手術切除率低，復發率高，而研究探討胰腺癌侵襲轉移的機制并尋找控制胰腺癌侵襲轉移的方法已成為目前研究的重點和難點。miRNA是一類重要的內源性單鏈非編碼小RNA分子，可調控細胞生物的發育、增殖、分化、代謝、凋亡和應激等過程[13]。miRNA是生物體內原長度約為20～30個核苷酸的非編碼小RNA，在進化上高度保守，通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平上對基因表達進行負調控，導致mRNA的降解和翻譯抑制。也有越來越多的研究表明[14]，miRNA與腫瘤的發生、發展等過程有著密切的關系，其中miRNA-10a 可能與腫瘤的侵襲和轉移有關。已有研究表明[15]，miR-10a與胃惡性腫瘤與胃惡性腫瘤轉移有關，且能夠觸發乳腺癌細胞的侵襲轉移，其機理與RhoC基因有關，但目前對于miR-10a在胰腺癌侵襲轉移中作用的報道較少。為此，本研究檢測分析了胰腺癌組織中miR-10a表達水平，并探討分析了miR-10與胰腺癌細胞遷移、侵襲和增殖的關系。

3.1 miR-10a與胰腺癌發生和發展的關系分析 本研究通過RT-PCR定量檢測胰腺癌組織和癌旁組織的miR-10a水平發現，胰腺癌組織的相對表達量明顯高于癌旁組織；進一步分析發現，miR-10a相對表達量與胰腺癌病理分級、淋巴結轉移和TNM分期有關，提示 miR-10a與胰腺癌的發生和發展有著密切的關系，且其表達水平與胰腺癌患者病情的嚴重程度有一定的關系，而miR-10a的檢測可能能為胰腺癌的早期診斷提供一定的依據，但具體臨床價值仍需作進一步的深入研究。

3.2 miR-10a與胰腺癌侵襲轉移的關系分析 腫瘤的侵襲性生長和遠處轉移是導致腫瘤治療效果不佳的主要原因之一，而過往的研究也表明，miR-10a表達量的增加與肝癌細胞系、乳腺癌細胞系、腦垂體瘤、神經膠質瘤、食管癌和鼻咽癌的侵襲和轉移呈正相關。本研究以脂質體轉染法將miR-10a重組正、反義真核表達質粒載體轉染Capan-1細株發現，轉染48 h后正義組miR-10a相對表達量明顯高于反義組、空載組和空白對照組，而反義組miR-10a相對表達量明顯低于空載組和空白對照組。通過MTT檢測細胞增長率發現，正義組24 h和48 h OD值明顯高于反義組、空載組和空白對照組，而反義組24 h和48 h OD值明顯低于空載組和空白對照組，提示miR-10a高表達可促進腫瘤的增長，而下調miR-10a的表達可抑制腫瘤的增長。進一步進行侵襲實驗發現，正義組遷移和侵襲細胞數明顯高于反義組、空載組和空白對照組，而反義組遷移和侵襲細胞數明顯低于空載組和空白對照組，提示 miR-10a與胰腺癌細胞的侵襲和遷移有著密切的關系，其高表達可促進細胞的侵襲和遷移，而通過下調miR-10a的表達可明顯抑制胰腺癌細胞的侵襲和遷移。

本研究的創新之處在于探討分析了miR-10a表達與胰腺癌發生、發展、侵襲和遷移的關系，發現高表達的miR-10a可促進胰腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，而下調miR-10a的表達可抑制腫瘤的增長、侵襲和遷移，這可能能為控制胰腺癌的侵襲和遷移并提高胰腺癌的治療效果提供一條新的路徑，但能否將miR-10a作為新的胰腺癌治療靶點仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，miR-10a過表達可對胰腺癌有生長促進、增強侵襲和遷移的作用，值得進一步研究。

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(本文編輯：葉華珍； 英文編輯：王建東)

The role of miR-10a in invasion and metastasis of pancreatic cancer

XIE Rong-zhen，ZENG Xiang-fu，DENG Wei，LIU Xiao-ping，ZHANG Xin-hua

(DepartmentofGeneralSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity，Ganzhou341000，Jiangxi，China)

Objective To investigate the role of miR-10a in invasion and metastasis of pancreatic cancer. Methods Selected 68 cases of pancreatic cancer tissue in our hospital from January 2014 to December 2016, the adjacent tissues were selected as control, MiR-10a expression in tissue specimen was detected by RT-PCR; selected pancreatic cancer cell line Capan-1 cell, used liposome transfection method, MiR-10a recombinant positive and antisense eukaryotic expression vector was transfected into Capan-1 cells, the expression of miR-10a in transfected cells was detected by RT-PCR, and the migration and invasion ability of transfected cells were observed by Transwell and Matrigel assay, the proliferation of cells was detected by MTT assay. Results The relative expression of miR-10a in pancreatic cancer tissues was (0.213±0.024), which was significantly higher than that in adjacent tissues (P<0.01); The relative expression of miR-10a in intermediate low differentiated pancreatic cancer was (0.212±0.011), which was significantly higher than that of high differentiated pancreatic cancer (P<0.01); The relative expression of miR-10a in lymph node metastasis of pancreatic cancer was (0.217±0.017), which was significantly higher than that without lymph node metastasis (P<0.05); The relative expression level of miR-10a in TNM stage III to IV pancreatic cancer was (0.230±0.015), which was significantly higher than that of stage I to II pancreatic cancer (P<0.01). After transfection of 48 h, the relative expression of miR-10a in positive group (0.021±0.010), was significantly higher than that of antisense group, empty vector group and blank control group (P<0.05); antisense miR-10a group relative expression was (0.003±0.001), significantly lower than the empty vector group and blank control group (P<0.05). Positive group 24 h and 48 h OD values were (0.602±0.018) and (0.753±0.041), were significantly higher than that of antisense group, empty vector group and blank control group (P<0.05); Antisense group 24 h and 48 h OD values were (0.451±0.023) and (0.591±0.038), and were significantly lower than that of empty vector group the blank control group (P<0.05). Positive group cell migration and invasion were (85.22±12.10) and (140.24±30.54), were significantly higher than that of antisense group, empty vector group and blank control group (P<0.05); antisense group cell migration and invasion were (12.52±3.22) and (20.41±8.66), were significantly higher than that of empty vector group and blank control group (P<0.05). Conclusion Overexpression of miR-10a can promote the growth and enhance the invasion and migration of pancreatic cancer, which is worthy of further study.

miR-10a; Pancreatic cancer; Invasion; Migration; Clinic opathological features; Transfection

贛州市指導性科技計劃項目(GZ2015ZSF100)

341000贛州，贛南醫學院第一附屬醫院普外二科

謝榮臻，曾祥福，鄧 偉，等.miR-10a在胰腺癌侵襲轉移中的作用[J].東南國防醫藥，2017,19(4):352-356.

R735.9

A

1672-271X(2017)04-0352-05

10.3969/j.issn.1672-271X.2017.04.005

2017-05-10;

2017-06-14)