松齡血脈康膠囊對自發性高血壓大鼠高血壓相關基因表達的影響

施偉麗,王 燕,信琪琪,徐 磊,滕傳震,陳可冀△,叢偉紅

(1.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.成都康弘制藥有限公司，成都 610036)

【實驗研究】

松齡血脈康膠囊對自發性高血壓大鼠高血壓相關基因表達的影響

施偉麗1,王 燕2△,信琪琪1,徐 磊3,滕傳震3,陳可冀1△,叢偉紅1

(1.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.成都康弘制藥有限公司，成都 610036)

目的：:探討松齡血脈康對自發性高血壓大鼠血壓的干預作用及機制。方法：自發性高血壓大鼠隨機分組后，分別灌胃給予松齡血脈康和氯沙坦鉀，連續給藥9周，每周檢測收縮壓、舒張壓變化。以HE染色觀察藥物對大鼠主動脈病理組織形態學影響，qPCR陣列技術檢測高血壓相關因子RNA水平的變化，繼而借助String及KEGG Pathway數據庫對差異基因進行網絡分析。結果：給藥9周后，與模型組比較高劑量松齡血脈康組及氯沙坦鉀組大鼠的收縮壓、舒張壓均顯著降低；高劑量松齡血脈康組大鼠血漿中血管緊張素Ⅱ水平較模型組明顯降低，且與氯沙坦組比較特別顯著性降低；對qPCR篩選得到的12個差異表達基因進行網絡分析發現，Pde5a、Prkg1、Gucy1b3和Prkg2相互作用明顯，且均參與cGMP-PKG通路的活化。結論：松齡血脈康降低自發性高血壓大鼠血壓，其機制可能與降低大鼠血漿中AngⅡ水平、調控差異表達基因Pde5a、Prkg1、Gucy1b3和Prkg2共同參與的cGMP-PKG通路有關。

松齡血脈康；高血壓；qPCR陣列檢測

高血壓病是以血壓升高為主要臨床特征的綜合征，迄今依舊是心血管疾病死亡的重要原因之一。松齡血脈康膠囊由葛根、鮮松葉、珍珠層粉組成，具有平肝潛陽、鎮心安神的功效，臨床用于高血壓、高血脂的治療，并取得了一定療效[1-2]。已有研究發現，松齡血脈康可降低自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血漿中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、醛固酮含量及肝臟血管緊張素轉換酶、血管緊張素Ⅱ一型受體mRNA的表達水平，提示松齡血脈康可能通過影響腎素-血管緊張素-醛固酮水平調控血壓[3]；也有研究顯示，松齡血脈康可能通過激活PI3K/Akt信號通路，維持自發性高血壓大鼠心臟正常的收縮和舒張功能[4]。但目前有關松齡血脈康降壓作用分子機制的研究尚不深入。本文以qPCR陣列技術對高血壓相關基因進行篩選研究，以期為闡明松齡血脈康降壓作用的分子機制和臨床應用提供更多的可靠依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級9周齡雄性自發性高血壓大鼠(SHR)40只，9周齡雄性wistar kyoto大鼠(WKY)10只，購自北京維通利華實驗動物有限公司(合格證書號SYXK(京)2012-0012)，飼養于中國中醫科學院西苑醫院SPF級動物房，自由取食及飲水，12 h明暗交替控制(光照時間8∶00-20∶00)。

1.2 實驗藥物及試劑

氯沙坦鉀片由杭州默沙東制藥有限公司提供(批號L016172),松齡血康膠囊由成都康弘有限公司提供(批號160216)，藥物組成成分：鮮松葉、葛根、珍珠層粉；RNA提取試劑盒(Roche：11667165001)，All-in-OneTMFirst-Strand cDNA 合成試劑盒(GeneCopoeia：AORT-0050)，All-in-OneTM qPCR Mix(GeneCopoeia：AOPR-0200)，All-in-OneTM qPCR引物(GeneCopoeia)。

1.3 實驗儀器

智能無創鼠尾壓測量儀(日本BP98AWU)，全自動生化分析儀(日本日立公司7600)，脫水機(武漢俊杰電子有限公司JJ-12J)，包埋機(武漢俊杰電子有限公司JB-P5)，病理切片機(上海徠卡儀器有限公司RM2016)，凍臺(武漢俊杰電子有限公司JB-L5)，組織攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司KD-P)，烤箱(上海慧泰儀器制造有限公司DHG-9140A)，正置光學顯微鏡(日本尼康ECLIPSE CI)，成像系統(日本尼康DS-U3)，NanoDrop? Lite紫外分光光度計(美國賽默飛)，LightCycler480 PCR儀(美國羅氏)。

2 方法

2.1 分組及給藥方法

40只9周齡雄性SHR大鼠適應性飼養1周后，隨機分為模型組、氯沙坦鉀組、高劑量和常規劑量松齡血脈康組4組各10只，以WKY大鼠為正常對照組。氯沙坦鉀片研磨后按每天31.5 mg·kg-1灌胃給藥，高劑量松齡血脈康組以每天1 g·kg-1灌胃，常規劑量松齡血脈康組以每天0.5 g·kg-1灌胃，模型組及正常對照組給予等體積生理鹽水，給藥9周。

2.2 血壓測定與樣本采集

每周檢測大鼠尾動脈血壓，每次檢測重復3次取其平均值；腹主動脈采血，西苑醫院檢驗科檢測大鼠血漿中AngⅡ水平；取材胸主動脈用于HE染色及qPCR陣列檢測。

2.3 病理組織學檢測

胸主動脈用福爾馬林固定、石臘包埋、切片后用HE染色，觀察主動脈病理形態變化。

2.4 qPCR陣列檢測

提取組織RNA后用All-in-OneTMfirst-strand cDNA synthesis kit 將RNA逆轉錄為cDNA；混合cDNA模板和All-in-OneTMqPCR mix，將混合液滴入孔中；在Real-time PCR儀中進行反應；運用GeneCopoeia的網上數據分析工具分析數據。

2.5 所得差異基因的網絡分析

結合String(http://www.string-db.org)和KEGG Pathway(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)數據庫對所得基因進行網絡分析。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 松齡血脈康對自發性高血壓大鼠血壓的影響

松齡血脈康對自發性高血壓大鼠收縮壓的影響 表1顯示，給藥1周后氯沙坦鉀組收縮壓、舒張壓較模型組顯著性降低(P<0.01)；5周后高劑量松齡血脈康組收縮壓、舒張壓逐漸降低，且較模型組降低明顯(P<0.05)；給藥9周后氯沙坦鉀組、高劑量松齡血脈康組收縮壓、舒張壓較模型組均顯著下降，且高劑量松齡血脈康收縮壓與氯沙坦鉀組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

組 別鼠數0周1周2周3周4周5周6周7周8周9周對照組10SBP98.38±13.95110.74±18.32112.52±17.99114.29±9.79110.37±9.75119.78±10.08106.21±17.02107.58±12.78109.27±13.78109.94±14.48DBP65.96±8.569.58±18.370.29±20.9475.21±6.3374.53±11.2177.08±13.3170.46±12.9572.92±9.5171.69±12.176±12.42模型組10SBP136.1±15.01**147.55±9.26**150.84±8.69**157.56±7.26**156.26±10.11**161.06±5.91**158.4±5.4**161.27±7.56**163.24±3.95**164.61±6.55**DBP104.62±14.43**105.49±10.65**109.1±11.49**115.87±10.75**109.13±15.35**118.82±14.88**113.4±11.81**118.73±9.85**120.47±10.26**117.21±15.06**氯沙坦鉀組10SBP140.27±6.46127.25±12.16△△144.73±10.13141.76±13.64△△142.83±11.43△△136.17±16.27△△143.13±9.75△148.61±10.97△△145.01±13.22△△144.9±16.27△△DBP108.46±9.7983.06±14.9△△102.91±8.37102.59±16.72△△104.07±8.4898.05±15.85△△101.73±19.87106.18±12.78△△100.02±13.27△△103.26±14.93△△松齡血脈康高劑量組10SBP143.11±10.82141.69±12.88##149.46±12.77147.38±10.43△151.64±13.88#149.23±12.67△140.33±21.57△150.36±6.86△△148.48±10.5△△149.99±13.31△△DBP101.09±10.57100.33±18.01##104.02±13.11104.01±15.73△109.98±20.84105.85±15.27△99.33±20.64△108.27±9.55△106.67±14.22△△107.86±17.31△松齡血脈康常規劑量組10SBP130.31±18.52139.09±13.76#151.29±7.09148.52±13.61△155.61±10.71##145.84±14.54△△140.29±20.32△151.95±14.15△153.6±12.44△154.24±9.27△#DBP100.85±11.6994.24±13.01△#107.51±7.99103.11±12.51△△114.57±14.6598.46±17△△102.67±20.17106.33±15.41△△113.23±15.03##118.9±13.77##

注：SBP：收縮壓，DBP：舒張壓；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與氯沙坦鉀組比較：#P<0.05，##P<0.01

3.2 松齡血脈康對自發性高血壓大鼠主動脈病理形態影響

圖1顯示，從A組圖中可看出，模型組大鼠主動脈壁厚薄不一，而對照組和藥物組主動脈壁厚度相對均勻；從B組圖中可以看出，模型組主動脈壁厚度較對照組明顯增加，給藥組厚度較模型組有降低。

圖1 松齡血脈康對自發性高血壓大鼠主動脈病理形態影響注：“←”所示為模型組主動脈壁厚薄不一，“—”表示主動脈內中膜厚度

3.3 松齡血脈康對自發性高血壓大鼠血漿AngⅡ的影響

圖2顯示，高劑量松齡血脈康組AngⅡ水平較模型組明顯降低(P<0.01)，且與氯沙坦鉀組比較降低顯著(P<0.01)；氯沙坦鉀組AngⅡ水平較模型組未見明顯差異，但有升高趨勢，可能與氯沙坦鉀與血管緊張素搶占組織中AngⅡ受體，使更多的AngⅡ游離至血液中有關。

圖2 松齡血脈康對自發性高血壓大鼠血漿AngⅡ的影響注：與對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：△△P<0.01；與氯沙坦鉀組比較：#P<0.05，##P<0.01(n=10)

3.4 高血壓差異表達基因篩選

圖3 模型組與對照組qPCR陣列結果

圖3、4顯示， 以模型組與對照組、高劑量組松齡血脈康與模型組進行對照比較，分析、篩選高血壓差異表達基因[5]。本實驗中，以高劑量組松齡血脈康與模型組比較，共得到表達有變化基因53個，其中上調22個，下調因子31個，上調基因中差異倍數≥1.5的有12個，下調基因中差異倍數≥1.5的有16個；以模型組與對照組比較，共得到59個有變化的基因，其中上調基因28個，下調基因31個；上調基因中差異倍數≥1.5的有19個，下調基因中差異倍數≥1.5的有20個。

圖4 模型組與對照組qPCR陣列結果

表2顯示，繼而對高劑量松齡血脈康組與模型組比較，模型組與對照組比較結果中的基因按下述條件進行二次篩選：(1)同時存在；(2)基因差異倍數≥1.5；(3)調控趨勢相反，最終得到12個差異基因。其中，Clic5、Gch1、Prkg2、Adrb1、Gucy1b3、Mylk2在松齡血脈康與模型組的比較結果中上調，而在模型組與對照組的比較結果中下調；相反，Mas1、Npy1r、Acta2、Mylk、Prkg1、Pde5a在松齡血脈康與模型組結果中下調，而模型組與對照組比較結果中上調。

3.5 松齡血脈康調控高血壓相關差異表達基因的網絡分析結果

從圖5顯示，磷酸二酯酶5a(phosphodiesterase 5A，Pde5a)、環磷酸鳥苷酸依賴的1型蛋白激酶(protein kinase，cGMP-dependent, type II，Prkg1)、Prkg2、鳥苷酸環化酶可溶性蛋白亞基1β3(guanylate cyclase 1 soluble subunit beta 3，Gucy1b3)關系密切，各基因間相互作用。String的KEGG pathway分析結果提示，cGMP-PKG通路(map號04022)在被篩選的相關信號通路中處于核心位置，且上述4個基因均參與該通路的活化。

表2 高劑量松齡血脈康組與模型組、模型組與對照組比較所得差異基因

圖5 松齡血脈康調控差異基因的網絡分析注：紅色字母表示高劑量松齡血脈康組上調的基因，黑色字表示下調的基因

4 討論

松齡血脈康是在“血脈同治”理論的指導下組成的復方，由葛根、鮮松葉、珍珠層粉組成，具有平肝潛陽、鎮心安神的功效。其中鮮松葉是松齡血脈康的君藥，其性溫，味苦，歸心、肝、脾經，國內外對松葉的化學成分研究主要集中在揮發油、木脂素、黃酮類、原花青素、莽草酸等化合物，藥理研究表明松葉有抗氧化、抗菌、調節血脂、抗衰老等作用[5-7]。葛根為方中臣藥，甘平，性涼，主入陽明經，能升舉清陽，化濁調脂，《本草綱目》載其:“散郁火”。葛根素是從中藥葛根中提取的具有異黃酮結構的單體化合物，廣泛用于心腦血管疾病的治療，能調節腎素-血管緊張素-醛固酮系統相關活性物質生成，抗氧化應激、抑制組織纖維化，增加胰島素敏感性，調節血脂和保護內皮[8-9]。松齡血脈康膠囊另一主要成分珍珠層粉是珍珠母去掉中、外層，保留珍珠層研制而成的細粉，其性寒味甘咸，入心、肝經，與鮮松葉配伍增強其平肝潛陽、鎮心安神的作用。依“血脈同治”的治療理念，高血壓病患者同時存在脈的病變和血的病變，而脈的病變主要體現在血管內皮損傷、血管平滑肌功能異常等[10]。故本研究以自發性高血壓大鼠主動脈為對象，探討松齡血脈康對血壓調控的可能分子機制。

環磷酸鳥苷(cGMP)是一種普遍存在的細胞內第二信使，介導大量的生理過程，在心血管系統中cGMP信號對疾病發生發展有重要調節作用，尤其對血管平滑肌和心肌功能至關重要。cGMP 水平的升高，是NO多種生物效應的分子基礎，如松弛血管平滑肌和抑制血小板聚集[11-12]。而cGMP是Gucy1b3(又名sGC)催化一氧化氮(nitric oxide，NO)的產物，同時cGMP活性受磷酸二酯酶(PDEs)的影響，PDEs具有水解胞內第二信使的功能。PDE5選擇性地作用于cGMP，cGMP被PDE5水解轉化為5-GMP而失活。研究結果表明，松齡血脈康組Gucy1b3顯著上調，而 PDE5a水平降低，提示松齡血脈康可能通過增加Gucy1b3活性、抑制PDE5a活性而增加cGMP的生物利用度，最終發揮保護主動脈舒張功能的作用。

cGMP通路下游的另一因子PRKG(又名PKG)在血壓調節中也發揮重要作用。多項研究顯示，PKG1基因是高血壓的易感基因，可通過增加細胞內Ca2+濃度調節血管張力，影響血壓[13-14]。研究[10]發現，血管平滑肌細胞長時間接觸硝基血管擴張劑、cGMP或cAMP類似物，將可能抑制PKG mRNA及其蛋白的表達[15]。同樣，在探討cGMP干預心肌細胞功能和內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidative stress，eNOS)干預轉基因小鼠主動脈功能的研究中，PKG的水平均降低[16-17]，推測cGMP的增加可能導致PKG水平降低，從而降低血壓。本研究中PKG1 RNA水平明顯降低，提示松齡血脈康可能通過降低PKG1 RNA水平調節主動脈的收縮功能。研究同時發現，與PKG1水平降低相反，PKG2 mRNA的水平顯著上調，但由于目前PKG2在高血壓中的研究較少，PKG2水平的變化是否對血壓產生影響以及產生何種影響，尚需進一步的研究。此外本研究證實，松齡血脈康能顯著降低大鼠血漿中AngⅡ水平，與已報道的實驗結果一致[3]，提示松齡血脈康的降壓作用可能與調節腎素-血管緊張素-醛固酮系統有關。

綜上，松齡血脈康膠囊能平穩降低自發性高血壓大鼠的血壓，利用qPCR陣列技術和網絡藥理分析，對松齡血脈康膠囊調控的高血壓相關基因進行篩選，發現松齡血脈康可能通過調節cGMP-PKG通路Gucy1b3、PKG1、PDE5a等基因表達而調控大鼠血壓，明確了松齡血脈康降壓的分子機制，為臨床松齡血脈康膠囊的應用提供依據。同時，我們也注意到，Gucy1b3、PDE5、PKG與NO代謝密切相關，而NO是調控氧化應激的重要分子，因此松齡血脈康是否對高血壓狀態下大鼠氧化應激損傷有保護作用，將是我們后續研究的內容。

[1] YANG XC, XIONG XJ, YANG GY,et al. Songling Xuemaikang Capsule for primary hypertension: A systematic review of randomized controlled trials[J]. Chin J Integr Med, 2015, 21(4): 312-320.

[2] 董珍宇, 高穎, 吳圣賢. 基于真實世界的松齡血脈康膠囊治療原發性高血壓研究[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志, 2013, 11(3): 274-275.

[3] 柳威, 王娟, 趙英強. 松齡血脈康膠囊對自發性高血壓大鼠RAAS系統的調控機制研究[J]. 中華中醫藥雜志, 2015, 30(4): 1322-1324.

[4] 李杰, 柳威, 趙英強. 松齡血脈康膠囊對自發性高血壓大鼠PI3K/Akt信號通路的調節機制探討[J]. 湖南中醫雜志, 2013, 29(7): 112-115.

[5] FENG S, ZENG W, LUO F,et al. Antibacterial activity of organic acids in aqueous extracts from pine needles (Pinus massoniana Lamb.)[J]. Food Science and Biotechnology, 2010, 19(1): 35-41.

[6] 鄭曉珂, 王小蘭, 馮衛生. 松針提取物對去卵巢大鼠肝臟脂質的影響[J]. 時珍國醫國藥, 2010, 21(2): 368-370.

[7] 單紅梅, 朱玉寶, 李從陽,等. 馬尾松針抗衰老機制的研究[J]. 遼寧中醫學院學報, 2006, 8(1): 91-92.

[8] ZHOU Y, ZHANG H, PENG C. Puerarin: A Review of Pharmacological Effects[J]. Phytother Res, 2014, 28(7): 961-975.

[9] ZHANG Z, LAM TN, ZUO Z. Radix Puerariae: an overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use[J]. J Clin Pharmacol, 2013, 53(8): 787-811.

[10] 高學敏, 張德芹, 陳可冀,等. 松齡血脈康膠囊“血脈同治”組方理論探析[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志, 2015, 13(6): 708-710.

[11] PALMER RM, FERRIGE AG, MONCADA S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor[J]. Nature, 1987, 327(6122): 524-526.

[12] SABINO JP, BOMBARDA G, DA SC,et al. Role of the spinal cord NO/cGMP pathway in the control of arterial pressure and heart rate[J]. Pflugers Arch, 2011, 461(1): 23-28.

[13] FRIESE RS, ALTSHULER AE, ZHANG K,et al. MicroRNA-22 and promoter motif polymorphisms at the Chga locus in genetic hypertension: functional and therapeutic implications for gene expression and the pathogenesis of hypertension[J]. Hum Mol Genet, 2013, 22(18): 3624-3640.

[14] SABBAGH A, LUISI P, CASTELLI EC,et al. Worldwide genetic variation at the 3′ untranslated region of the HLA-G gene: balancing selection influencing genetic diversity[J]. Genes Immun, 2014, 15(2): 95-106.

[15] SOFF GA, CORNWELL TL, CUNDIFF DL,et al. Smooth muscle cell expression of type I cyclic GMP-dependent protein kinase is suppressed by continuous exposure to nitrovasodilators, theophylline, cyclic GMP, and cyclic AMP[J]. J Clin Invest, 1997, 100(10): 2580-2587.

[16] WOLLERT KC, FIEDLER B, GAMBARYAN S,et al. Gene transfer of cGMP-dependent protein kinase I enhances the antihypertrophic effects of nitric oxide in cardiomyocytes[J]. Hypertension, 2002, 39(1): 87-92.

[17] YAMASHITA T, KAWASHIMA S, OHASHI Y,et al. Mechanisms of reduced nitric oxide/cGMP-mediated vasorelaxation in transgenic mice overexpressing endothelial nitric oxide synthase[J]. Hypertension, 2000, 36(1): 97-102.

Effects of Songling Xuemai Kang Capsule on the Expression of Hypertension Related Genes in Spontaneously Hypertensive Rats

SHI Wei-li1，WANG Yan2△，XIN Qi-qi1，XU Lei3，TENG Chuan-zhen3，CHEN Ke-ji1△, CONG Wei-hong1

(1.XiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing, 100091,China; 2.BeijinguniversityofChinesemedicine,Beijing100029,China; 3.ChengduKanghongPharmaceuticalCo.Ltd.,Chengdu610036,China)

Objective：To investigate the mechanism of Songling Xuemaikang Capsule (SXC) on blood pressure of spontaneously hypertensive rats (SHR). Methods: SHR were randomly divided into model group, high dose SXC group (H-SXC), normal dose SXC group(N-SXC) and losartan group. Blood pressures were measured every week. Pathological morphology of aorta was observed by HE staining. String and KEGG Pathway databases were used for network analysis of differentially expressed genes which related with hypertension and detected with qPCR arrays. Results: Compared with model group, bood pressure of H-SXC and losartan group decreased significantly after 9 weeks of irrigation. AngiotensinⅡlevel declined obviously compared with model group and even losartan group. 12 differentially expressed genes were screened by qPCR arrays and among which 4 genes including Pde5a, Prkg1, Gucy1b3 and Prkg2 participated in cGMP-PKG pathway. Conclusion: SXC could decrease increased blood pressure of SHR, the regulatory mechanism of which might be due to angiotensinⅡ, and the involvement of cGMP-PKG pathway.

Songling Xuemaikang Capsule; Hypertension; qPCR array

北京市“十病十藥”研發專項(Z141100002214011)-氣血并治顆粒的制劑開發研究

施偉麗(1987-)，女，河南人，在讀博士，從事中西醫結合心血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者：陳可冀(1930-)，男，院士，從事中西醫結合心血管疾病及老年病的臨床與研究，Tel：010-62835037，E-mail：kjchenvip@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)05-0634-04

2016-08-24