基于Na+-K+-ATP酶活性變化評價濕阻中焦證Cajal間質細胞模型的研究

王琦越，楊 旭，王吉娥，陳繼蘭，黃秀深

(成都中醫藥大學，成都 611137)

【實驗研究】

基于Na+-K+-ATP酶活性變化評價濕阻中焦證Cajal間質細胞模型的研究

王琦越，楊 旭，王吉娥，陳繼蘭，黃秀深△

(成都中醫藥大學，成都 611137)

目的：建立濕阻中焦證Cajal間質細胞模型并對其進行評價。方法：濕阻中焦證動物模型建立及動物血清制備；采用Ⅱ膠原酶消化法體外培養ICC，通過濕阻中焦證動物模型含藥血清建立體外濕阻中焦證Cajal間質細胞模型，模擬濕阻中焦證大鼠模型體內ICC的生長，以及平胃散含藥血清在濕阻中焦證治療中對ICC細胞的調節機制，反證證候細胞模型建立成功。結果：細胞造模后細胞內Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-Atpase)活力下降，K+濃度及ATP升高，ICC細胞無氧代謝能力增強；濕阻中焦證細胞經平胃散血清干預后，與自然恢復組比較平胃散組ICC細胞Na+-K+-Atpase和K+活性升高明顯、ATP下降、LDH活力降低。結論：濕阻中焦證ICC模型細胞與正常ICC存在差異，證侯細胞模型建立成功；鈉鉀泵活性的改變可能是濕阻中焦證的基本病理改變之一，平胃散可能通過恢復鈉鉀泵活性阻斷K+濃度的下降趨勢，影響中焦濕阻證Cajal間質細胞代謝。

中醫證候細胞模型；濕阻中焦證模型；平胃散；

濕阻中焦證是脾胃病的一類常見證型，起病具有廣泛性、隱匿性和復雜性等特點，嚴重影響生活質量，甚至給臨床各科的治療帶來諸多障礙。李連成[1]對石家莊1005人的抽樣調查顯示，符合濕阻者106人，患病率為10.55%。李克窮[2]對甘肅1735人的抽樣調查顯示，符合濕阻者211人，患病率為12.16%，說明濕阻中焦證研究的迫切性需引起重視。近年來,對濕阻中焦證的研究多從動物模型或胃腸道消化、吸收、運動機能減退等方面進行,亦有一部分學者認為濕阻中焦證的產生是源于細胞自身功能障礙。黃秀深[3]、隆淑芬[4]等先后對濕阻中焦證大鼠紅細胞膜、腦細胞膜研究發現Na+-K+-Atpase功能低下。本實驗以前期較成熟的濕阻中焦證動物模型為平臺建立體外中醫證候細胞模型，研究濕阻中焦證ICC內Na+-K+-Atpase活性的變化，以探索適宜Cajal間質細胞中醫證候模型的評價方法。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠40只，雌雄各半，體質量180～220 g，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(川)2004-11)，檢疫后備用。昆明種小鼠雌雄不拘，出生后10～15 d左右，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(川)2004-11)，檢疫后備用。

1.2 藥物

平胃散配方：蒼術24 g，厚樸18 g，陳皮12 g，炙甘草6 g,上藥購自同仁堂成都分店，經成都中醫藥大學制劑室鑒定合格。先將藥物加水 500 mL浸泡 1 h，然后與大棗2枚、生姜2片一同煎煮至300 mL 左右，再濃縮成濃度為1 g生藥/ml的藥液，4℃冰箱保存備用。

1.3 試劑

M199培養基(Gibco)，SCF(Peprotech)，Ⅱ型膠原酶(Gibco)，優級新生牛血清(民海生物工程有限公司，Lot.No.20090521)，青霉素(哈爾濱制藥六廠，批號 0903311)，鏈霉素(哈爾濱制藥六廠，批號070201)，無水乙醇0.01 mol/L PBS，大鼠抗小鼠c-kit抗體(武漢博士德)，羊抗大鼠FITC標記熒光抗體(Vector)，封閉用羊血清(北京中杉金橋)，Ficoll400(Pharmacia)， Na+-K+-ATP 酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20090723)，鉀測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號 20090923)，The CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay 試 劑(Promega, SystemLot#259984)，LDH 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號 20090923)。

1.4 儀器

相差倒置顯微鏡(Leica,090-35.008-000型，Germany)，酶聯免疫檢測儀(BIO-RAD,Mdel550型)，免疫熒光顯微鏡(Leica,DMIRE2)，二氧化碳培養箱(SANYO,MCO-15A型，JAPAN)，干熱消毒箱，高溫蒸汽滅菌高壓鍋。

2 方法

2.1 濕阻證動物模型建立與分組

SD大鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，正常組10只，造模組30只。模擬中醫發生濕困脾胃的病因“久居濕地，飲食不節，饑飽失常，睡眠減少，情志不遂”[5]，使大鼠居住在溫度18～25℃、濕度90%以上的造模箱內，每日上午用小站臺法控制睡眠時間5 h，單日禁食并給予4℃冰水灌胃1次(2 ml/只)，雙日供足充足飼料并給予豬油灌胃1次(4ml/只)，連續20 d。實驗過程中每天密切觀察大鼠的一般狀態，即糞便形狀、性狀、精神狀態、被毛色澤、活動狀態等，各組分別于造模前后及治療后各測量體質量1次。造模后動物的大便見黃褐色稀溏便，被毛色澤灰暗，體質量減輕，活動量小，飲食進水量較前減小。這些癥狀基本接近濕困脾胃證中濕邪困阻中焦的癥狀表現，認為動物模型成功。將造模后的30只SD大鼠又隨機分為模型組10只，平胃散治療組10只，自然恢復組10只。

2.2 血清制備

2.2.1 濕阻中焦證組模型血清制備 造模20 d后取血清，血清在室溫下靜置2～4 h，離心取上清。56℃滅活30 min，過濾除菌，-20℃冰箱保存備用。

2.2.2 其他組血清制備 停止造模后，灌胃平胃散(10 ml/kg)共3 d。同時自然恢復組和正常灌胃組0.9N.S(10 ml/kg)第3天灌胃1 h后取血清，血清在室溫下靜置2～4 h后離心取上清。56℃滅活30 min，過濾除菌-20℃冰箱保存備用。

2.3 體外小鼠小腸 ICC的培養和鑒定

2.3.1 ICC的培養 小腸組織單細胞懸液制備[6]：小鼠禁食12 h后，在無菌條件下取距離回盲部10 cm的小腸放入培養皿，剝去小腸系膜和血管，用PBS液(pH7.0，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)在50 ml小燒杯中將小腸內容物沖洗干凈，將小腸用2 ml注射器針頭縱行剖開小腸，剖去小腸黏膜層，PBS液反復沖洗肌條3～4次，將肌條剪碎至1～2 mm3小塊后放入小燒杯中，加入Ⅱ型膠原酶(1.3 mg5ml-1)，37℃消化30 min，過 200 目篩網，將含細胞的濾液1500 r離心3 min去上清，再重懸細胞 1次，細胞加在等體積Ficoll400梯度密度液上，3000 r離心10 min，取液面交界細胞沉淀。用 M199培養基將細胞密度調整至1×106個/ml接種至 6 孔培養板，板中預先放置包被鼠尾膠原(2 ng/cm2)的蓋玻片。放置培養箱，在37℃ 5% CO2條件下培養。細胞培養24 h后換液，沖去未貼壁細胞，加入培養基繼續培養，以后每3～4 d換液1次，期間用倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。細胞穩定培養7 d后，進行免熒光檢測以確定是否為ICC細胞。

2.3.2 ICC的鑒定 通過Cajal間質細胞的生長和形態學改變進行鑒定——體外培養小鼠小腸ICC特征性形態特點[7]：接種24 h后，ICC即可貼壁，細胞最初呈三角形或梭形，并有少量短突起。72 h可形成較長突起并與周圍細胞形成網絡狀突起連接。體外培養7d后，ICC可以伸出二級、三級突起，可形成較復雜的網狀連接。

2.4 含藥血清及相關血清細胞給藥濃度確定

預實驗中，分別用 10%、15% 和20%的平胃散含藥血清作用于ICC細胞，發現當含藥血清濃度為15%，對ICC的作用強于10%和20%濃度的含藥血清，對ICC 細胞的干預作用最明顯。因此，選擇15%含藥血清濃度作為本實驗的給藥濃度。

2.5 細胞造模及細胞分組給藥

將培養第7天的正常ICC分為正常組(給細胞加入2次正常組動物的血清)、模型組(給細胞加入2次濕證模型血清)、自然恢復組(先給細胞加入濕證模型血清,之后再給細胞加入自然恢復組的血清)、平胃散組(先給細胞加入濕證模型血清,之后再給細胞加入平胃散含藥血清)、四君子湯組(先給細胞加入濕證模型血清,之后再給細胞加入四君子含藥血清)，2次加血清時間間隔24 h，24 h后檢測指標。

2.6 樣本制備及指標測定

將待檢測的細胞制成細胞懸液移入離心管，以1500 rpm 離心15 min棄上清液。用不含血清的M199培養基洗3次棄上清液，加入200 μl去離子水，手動勻漿機破碎細胞，然后嚴格按照測定試劑盒說明操作。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 模型細胞與正常 ICC的形態差異

圖1顯示，倒置顯微鏡下觀察生長7 d的ICC形態，發現正常組ICC細胞ICC伸出二級、三級突起，從而形成較復雜的網狀連接，這種連接是其慢波功能的結構基礎(詳見圖A)；濕阻中焦證模型細胞形態發生變化，細胞變平，突觸連接緊密，細胞縫隙變小，網絡連接不明顯(詳見圖B)。

圖1 模型細胞與正常ICC的形態差異(10×40)注：A.正常ICC;B.濕阻中焦證ICC

3.2 模型細胞與正常 ICC的差異

表1顯示，與正常 ICC 比較，模型組細胞內 ATP 明顯提高(P<0.01)、K+濃度升高(P<0.01)，LDH 明顯增強(P<0.01)，但模型組細胞內Na+-K+-Atpase明顯降低(P<0.01)。

組 別例數濃度(ng/ul,%)ATP(U/mg)Na+-K+-ATP(U/mg)K+(U/mg)LDH(U/mg)空白組6151892217.33±25523.752.99±0.190.14±0.001.38±0.06正常組6151750106.33±22903.883.80±0.380.10±0.000.44±0.05模型組6152327674.00±48830.90**2.78±0.28**0.12±0.00**0.60±0.05**

注：與正常組比較：**P<0.01

3.3 濕阻中焦證動物模型血清對模型ICC的影響

表2顯示，與正常組ICC 比較，模型組、自然恢復組及四君子湯組細胞內ATP均升高(P<0.01)，其中平胃散組ATP明顯降低(P<0.01)；與正常組ICC比較，自然恢復組LDH降低(P<0.01)，模型組、四君子湯組細胞內LDH卻有升高趨勢，但差異無統計學意義；與正常組比較，模型組、自然恢復組、平胃散組及四君子湯組Na+-K+-Atpase活力均降低(P<0.01)，其中平胃散組Na+-K+-Atpase活力最強，而四君子湯組Na+-K+-Atpase活力最弱(P<0.01)；與正常組比較，模型組、自然恢復組、平胃散組及四君子湯組K+均升高(P<0.01)。

組 別例數濃度(ng/μl,%)ATP(U/mg)LDH(U/mg)Na+-K+-ATP(U/mg)K+(U/mg)正常組6151750106.33±22903.88 0.44±0.053.80±0.380.10±0.00模型組6152327674.00±48830.90**口口0.60±0.052.78±0.28**0.12±0.00**自然恢復組6151838815.33±48604.12**0.17±0.06**△△2.32±0.29**0.11±0.00**平胃散組6151203424.00±18626.08**0.42±0.04口口3.50±0.11△△口口0.12±0.00**四君子湯組6152461678.66±68393.11**△△口口0.46±0.04口口1.53±0.16**△△0.11±0.01**

注：與正常組比較:**P<0.01；與模型組比較:△△P<0.01；與自然恢復組比較:口口P<0.01

4 討論

濕阻中焦證又稱濕困脾胃證，是指濕邪阻滯脾胃，中焦氣機失于宣暢，運化功能減弱的病癥。臨床表現為全身困重倦怠、腹脹納呆、口黏苔膩及血清胃泌素降低、胃腸推進遲緩[8]等。胃腸節律的發生起源于胃腸道內的 Cajal 間質細胞(interstitial cell of Cajal，ICC)，ICC 是目前胃腸道節律運動的發起者和調控者[9]?，F代研究認為，濕阻中焦證的病理改變以胃腸運動紊亂與水液代謝障礙為主。而鈉鉀泵是一種鑲嵌在細胞膜上具有ATP酶活性的特殊蛋白質，維持著細胞內外離子的正常分布和滲透壓平衡，進而維持細胞內外的水平衡。

本研究通過造模成功的動物模型[10]血清建立濕阻中焦證ICC細胞模型。從研究結果來看，ICC細胞形態發生了一系列明顯變化，與前期研究發現胃腸動力障礙患者ICC 細胞數量減少、形態和網絡結構變化一致，提示濕阻中焦證ICC 細胞模型從形態上看出了胃腸動力障礙表現。此外，位于細胞膜上的Na+-K+-Atpase通過消耗能量保持著細胞內外k+濃度差和滲透壓平衡，內源性三磷酸腺苷(ATP)是活細胞代謝最重要的能量來源，而乳酸脫氫酶(LDH)作為一種主要的無氧酵解酶參與細胞的無氧代謝。造模后細胞內Na+-K+-Atpase酶活力明顯下降，K+濃度及ATP升高，無氧代謝能力增強，說明正常ICC經造模后細胞代謝發生了一定變化，提示模型細胞與正常ICC存在差異，推測濕阻中焦證證候細胞模型建立成功；且模型細胞Na+-K+-Atpase活力明顯下降，K+濃度升高，提示鈉鉀泵活性的下降是中焦濕阻證的基本病理改變之一。中醫認為，脾胃功能與水谷精微物質的吸收相關?！端貑枴そ浢}別論》云:“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精,上歸于肺，通調水道，下輸膀胱。水精四布，五經并行。”濕困脾胃證中脾胃功能被阻遏，致使水谷精微不能正常運化吸收，必然導致物質能量代謝的失常，從而致Na+-K+-Atpase活力降低。

平胃散是針對濕阻中焦證而創立的經典方劑，可通過提高免疫改善腸黏膜屏障功能治療濕困脾胃證[11-12]，所以選用平胃散進行藥物反證。本實驗中焦濕阻證 ICC 細胞經平胃散治療后，鈉鉀泵的活性恢復明顯優于自然恢復組，并阻斷K+濃度的下降趨勢，進一步說明中焦濕阻證的病理改變與細胞膜鈉鉀泵活性降低有關。平胃散可能通過恢復鈉鉀泵活性，阻斷K+濃度的下降趨勢，影響中焦濕阻證Cajal間質細胞代謝，從而調節胃腸道的運動功能。平胃散組ICC細胞內鈉鉀泵活性增加，耗能增加，ATP減少。平胃散降低中焦濕阻證 ICC 細胞內乳酸脫氫酶(LDH)活力，抑制濕證 ICC 細胞內的無氧代謝，提高細胞有氧代謝。四君子湯為治療脾氣虛證的代表方，作用不及平胃散。本研究中用于佐證濕阻中焦證ICC細胞模型建立成功。本實驗發現，濕阻中焦證ICC模型細胞與正常ICC存在差異，證侯細胞模型建立成功；鈉鉀泵活性的改變可能是濕阻中焦證的基本病理改變之一。平胃散可能通過恢復鈉鉀泵活性，阻斷K+濃度的下降趨勢，影響中焦濕阻證Cajal間質細胞代謝。本研究從細胞分子水平揭示濕阻中焦證能量代謝情況，也是體內中藥復方作用機制在體外研究的延伸, 對體外中醫證候細胞模型的建立作創新性的嘗試，為中醫“證”的研究提供新的研究思路和方法。目前細胞模型尚存在不足，國內外許多學者正致力于完善細胞模型，已經有研究[13]致力于改進培養條件，發展自動化、微型化的細胞模型，旨在擴大其應用范圍和評價效率，細胞模型將具有很好的開發前景。

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Study on Evaluation of Interstitial Cells of Cajal Model in Dampness Obstructing Spleen and Stomach Syndrome Based on the Na-K-ATP Enzyme Activity Changes

WANG Qi-yue,YANG Xu,WANG Ji-e,CHEN Ji-lan,HUANG Xiu-shen△

(ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective: Establishement and evaluature of of interstitial cells of Cajal spleen and stromach bloked by dampness syndrone in vitro study.Methods: The dampness obstructing spleen stomach syndrome animal model establishment and animal serum preparation; ICC cultured in vitro by collagenase Ⅱ,The dampness containing animal serum in vitro model of middle energizer dampness obstructing spleen stomach syndrome of interstitial cells of Cajal model,Simulation of rat model in vivo ICC growth,Pingwei power and serum regulating mechanism of ICC cells in the treatment of dampness syndrome.The successful establishment of cell model counterevidence syndrome.Results:After the cell model was made, the Na+-K+-ATP enzyme activity decreased, K+concentration and ATP increased, and the anaerobic metabolism ability of ICC cells was enhanced.Wet resistance of middle energizer cells through a flat stomach scattered serum intervention, and natural recovery group compared, flat stomach scattered group ICC Na+-K+-ATPase and K activity was significantly increased, the decline in ATP and LDH activity decreased.Conclusion:The dampness obstructing spleen stomach syndrome ICC model cells and normal ICC have differences. The successful cell model was established successfully,the sodium pump activity is the basic pathological change in the change of the dampness obstructing spleen stomach syndrome,and the level of the stomach may be through the recovery of sodium potassium pump activity,Blocking the downward trend of K+concentration of dampness obstructing spleen stomach syndrome in the Cajal interstitial cell metabolism.

TCM Syndrome Model;The dampness obstructing spleen stomach syndrome rat model;Ping Wei powder

國家自然科學基金資助項目(81373544)-平胃散對濕阻中焦證AQPS損傷致水平衡失調

王琦越(1992-)，女，醫學學士，從事消化系統疾病復方配伍規律的理論、臨床與實驗研究。

△通訊作者：黃秀深(1955-)，男，重慶人，教授，從事消化系統疾病復方配伍規律的理論、臨床及實驗研究，Tel：13608031734，E-mail：jcbl7747@sina.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)05-0630-04

2016-09-11