鐵皮石斛種子在“組織培養技術”實驗拓展中的應用

謝婷婷 李小雪 王 靜 陳 潔 陳炳華

(福建師范大學生命科學學院 福州 350117)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)，是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，亦是一種傳統的中藥材，全株可供藥用，具有抗腫瘤、抗衰老和提高人體免疫力等功效[1]。鐵皮石斛廣泛分布于浙江、福建、安徽、廣西和云南等省，自然生長于巖石或樹干上。近些年來，由于人類的過度采集和生境的破壞，鐵皮石斛的野生種群急劇減少。為滿足市場需求，科研人員利用植物組織培養技術開展了鐵皮石斛產業化的生產，成功地培養出種苗，移栽至大棚[1]，進而規模化地栽植于梨(Pyrus×michauxii)、杉木(Cunninghamialanceolata)和木荷(Schimasuperba)等植株樹干上，帶來經濟效益的同時，解決了鐵皮石斛野生資源匱乏的難題。目前，鐵皮石斛種苗的產業化采用“種子非共生性萌發”的方法，依據的原理是其單個蒴果中種子數量極多、體積小且無胚乳，在無菌的培養基及人工培養條件下，種子萌發率高。

目前，中學生做植物組織培養實驗往往由于污染問題影響了實驗的成功，其中外植體污染是重點難題之一[2]。在人教版生物學(選修1)《生物技術實踐》的專題3“植物的組織培養技術”中，采用的材料為新鮮的外植體。由于外植體長期暴露于空氣中，本身帶有一些菌，加之外植體的結構較不規整，影響了徹底消毒。眾所周知，在組培實驗過程中，愈傷組織的形成是該實驗成功的關鍵一步，但在實踐操作中，往往因為消毒過度直接導致外植體的死亡，或者因消毒不充分，將外源菌帶入培養基中，造成培養基的污染，進而影響了愈傷組織的形成，最終造成實驗失敗或結果不理想的多。這些將在一定程度上挫傷學生對該實驗的積極性，同時難以實現教學目標，導致學生對植物組織培養技術的感性認識缺失。

為此，如果能提供一種自然條件下無菌或少菌的胚(相當于已消毒適當的外植體)為材料，讓學生開展“植物組織培養技術”實驗，實驗成就感和自信心則大大地提升。筆者認為，鐵皮石斛的種子是該實驗專題拓展設計的好材料，尤其適合于南方地區的學校開展教學。

1 實驗材料的選取

鐵皮石斛采自人工種植的苗圃，系自然結實的蒴果。鐵皮石斛果實呈紡錘形，成熟時果皮由綠轉淺黃色，長約2.4 cm，重不足1 g(表1)。采用“差減法與粘取計數法”相結合[3]的方法對蒴果內種子進行科學計數，結果見表1。

表1 鐵皮石斛的蒴果和種子數

表1表明，成熟的鐵皮石斛蒴果中含有近15萬粒的種子。種子數目之多，可為組織培養教學提供大量的材料。自然條件下，果實成熟后果皮開裂，種子隨風飄落在樹干或巖石上傳種接代。但鐵皮石斛的種子需要經過特定的真菌感染后才能萌發，因此自然萌發率極低。顯微鏡下，種子呈紡錘形且不規則，中間膨大的部分有一個呈鮮黃色的胚，其余部分為種皮，種皮的一端較細尖，另一端較寬鈍(見圖1-A)。只有在外源能量(人工培養基)合適的條件下，種子才能萌發，并發育成苗。

為此，選取蒴果中的種子作為外植體是可取的。這完全有別于其他有胚乳種子的播種發芽。

2 外植體的消毒

在蒴果內未開裂前，成熟的鐵皮石斛種子表面無菌。因此，外植體消毒就只要對蒴果果皮進行消毒即可。

具體流程如下：選擇成熟未開裂的蒴果，先用流水沖洗干凈，在超凈工作臺內將清洗完畢的蒴果置于體積分數為75%乙醇中浸泡3 min，并振蕩，接著用無菌水沖洗2～3次后；再用75%乙醇(考慮到升汞溶液本身有毒，在中學階段學生不宜接觸且在實驗室其廢液不好處理等原因[4])處理5 min，用無菌水沖洗5次。

3 原球莖的分化

將已消毒的蒴果置于無菌濾紙上，用解剖刀(事先高壓滅菌過)切開蒴果果皮，然后用鑷子將果殼夾住，在培養瓶瓶口輕輕抖動，邊抖邊轉動培養瓶，使種子均勻地灑在MS培養基表面。為使種子均勻分布，可事先在培養瓶中滴加3～5滴的無菌水。一個蒴果可接種5～10瓶。培養條件[1]：光照強度1500～2000 Lx，溫度為(26±2)℃，光照時間為12 h/d。培養4 d的情況，如圖1-B。種子在培養5 d后逐漸由黃變綠，10 d后胚發育明顯(圖1-C)。隨著胚進一步膨脹，綠色逐漸加深，其形狀近似橢球體，胚的兩端呈不對稱，一端較另一端有突起出現，部分種皮逐漸消失。橢球體以原球莖途徑進行生長，在原球莖頂端突起一小綠點，后逐漸縱向伸長，形成葉原基并逐漸增大長成第一片幼葉(圖1-D)。

4 生根培養

培養41 d后，將形成的原球莖轉接至含10%香蕉汁和0.1g/L活性炭的MS培養基進行生根培養。培養條件與原球莖的分化一致。

原球莖的底部顏色逐漸變淺，呈現為乳白色漸漸分化為白色的根，繼續培養，最終發育成幼苗(圖1-E和圖1-F)。

圖1 鐵皮石斛種子及非共生性萌發結果

5 討論

結實率高、其蒴果內種子數量多，這是鐵皮石斛種子作為“組織培養技術”專題教學供選拓展材料的前提。在實際的教學中，采用鐵皮石斛的種子作為實驗材料具有取材方便，經濟等優點。此外，在未開裂的鐵皮石斛蒴果中，其種子始終處于封閉環境中，是潔凈無菌的[5]。

因此，采用鐵皮石斛種子作為“組織培養技術”專題教學的拓展材料，能有效避免因消毒不當而導致實驗結果不理想的結果，有利于增強學生對該實驗的信心及積極性，促進學生感性知識的獲取，從而內化形成理性認識。

所以，將鐵皮石斛作為南方地區中學開展“組織培養技術”專題教學的拓展材料是合適的。