脈沖場凝膠電泳技術及其在細菌感染性疾病中的應用

豆清婭(DOU Qing-ya)，吳安華(WU An-hua)

(中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008)

(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

·綜述·

脈沖場凝膠電泳技術及其在細菌感染性疾病中的應用

Pulsed-field gel electrophoresis and its application in bacterial infectious diseases

豆清婭(DOU Qing-ya)，吳安華(WU An-hua)

(中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410008)

(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

脈沖場凝膠電泳； PFGE； 應用； 基因分型； 追蹤傳染源

為研究細菌的流行特征、追蹤傳染源，國內外廣泛采用的方法是對相關菌株進行分型，分析菌株間的同源性關系。細菌分型方法分為表型分型和基因分型兩種，表型分型主要有根據菌落形態和生化特征等的生物分型、抗菌藥物藥敏譜分型、血清分型、噬菌體分型，基因分型包括質粒分型、核糖體分型、染色體DNA限制性內切核酸酶圖譜分析(REA)、限制片段長度多態性分析(RFLP)、脈沖場凝膠電泳分型(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)、隨機引物PCR(AP-PCR)、重復片段PCR分型、多位點序列分型(MLST)等，其中PFGE是分子分型技術的“金標準”，其結果重復性好，分辨率高，易于標準化，被國內外研究者廣泛接受。本文就PFGE技術及其在細菌感染性疾病中的應用進行綜述。

1 原理

1984年,美國科學家Schwartz等[1]發明了PFGE技術，該技術是用合適的限制性核酸內切酶對整個細菌的全基因組DNA進行消化，產生數量有限(一般5～20個)長度不等的DNA片段，在普通瓊脂糖凝膠中電泳分離。DNA片段超過一定大小時，DNA雙螺旋的半徑超過凝膠的孔徑，在普通瓊脂糖中的電泳速度達到極限，此時不能按照分子大小分離DNA分子。但大片段DNA分子可在不斷變化的脈沖電場中進行電泳，不斷重新定向，在凝膠中分離開，通過比較DNA分子的電泳條帶圖譜，判斷細菌型別。PFGE技術是對細菌的全基因組DNA進行原位酶切，可以反映細菌的整個基因情況，包括基因組的微小變化，如酶切位點的突變、基因序列的丟失或插入造成的條帶改變等，對細菌的遺傳特征研究有重要意義。

2 結果判斷

(1)PFGE圖譜條帶大小和數量相同為同一型別；(2)2～3個條帶出現差異的為親緣關系密切；(3)4～6個條帶差異者為可能相關；(4)7個或以上條帶不同為無親緣關系[2]。圖譜常用BioNumerics軟件進行分析，結果用百分率表示，由于細菌之間有變異性，在圖譜分析中相似值在85%以上的菌株認為流行病學相關。

3 主要影響因素

(1)緩沖液溫度：溫度升高，電泳速度加快，電泳時間縮短，條帶的分辨率下降；溫度較低時條帶的分辨率提高，電泳時間延長，溫度一般設置在14 ℃。(2)脈沖角度：降低脈沖角度，DNA電泳速度加快，條帶的分辨率高。因此，大片段DNA分子電泳時，減小脈沖角度可以提高電泳速度和條帶的分辨率，但分子量小的DNA分子電泳時若采用較小的脈沖角度，條帶會被壓縮，脈沖角度一般選擇120°。(3)脈沖時間：若DNA分子變換方向的時間小于脈沖周期，DNA分子可根據分子量大小分離開。DNA分子越大，重排需要的時間越長，脈沖時間越長；DNA越小，重排需要的時間越短，需要的脈沖時間越短。(4)電泳時間：由DNA片段的遷移率決定，同時受脈沖角度、脈沖時間、電壓梯度等影響，需在保證條帶分辨率的前提下，優化電泳時間。

4 應用

4.1 研究菌株間的遺傳差異 Xie等[3]收集21株來自腹瀉患者的沙門菌株，發現3株來自上海和4株來自南京的H2S實驗陰性沙門菌PFGE分型圖譜有96%的相似度，說明H2S實驗陰性的沙門菌可能存在跨地區的傳播。Ciofi等[4]對來自25例患者的多重耐藥銅綠假單胞菌進行PFGE分型，共分為5型即A—E型，其中21株為A型，A型可分為6個亞型(A1—A6型)，A1型為主要型別，各亞型之間的相似度≥95%，9株A1型菌株分離自2011年3月—2012年1月，6株A4型菌株分離自2012年3—9月，B—E型均為散發的菌株。潘偉光等[5]收集3株金黃色葡萄球菌，1株分離自臍炎新生兒的臍分泌物，另2株分離自該新生兒健康母親左右兩側乳房分泌的乳汁，進行PFGE基因分型，發現3株菌的圖譜相似度為100%，推測金黃色葡萄球菌在母嬰間傳播的可能性大。近年來，耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯菌不斷增多，2013年Ma等[6]在臺灣首次分離到4株攜帶OXA-48基因的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，PFGE分型分為3型，其中2株菌屬于同一型，有流行病學關系，與其余2株菌無相關性。Zhao等[7]收集24株多重耐藥肺炎克雷伯菌，發現所有菌株β-內酰胺酶基因KPC-2均為陽性，同時攜帶2～3種超廣譜β-內酰胺酶基因， PFGE分為13型，其中分離自血液科患者(患急性白血病和高血壓)的39號菌與來自重癥監護病房(ICU)患者的35號菌均屬于G型，此兩例患者曾同期在ICU進行治療，可能ICU是病原菌傳播的重要場所，病菌通過患者傳播到其他病房，在患者抵抗力低下時造成感染，甚至導致死亡。因此，PFGE技術對常見細菌進行分型，結合菌株臨床資料分析菌株間的遺傳關系，有利于進一步分析菌株間的傳播和擴散情況。

4.2 對疑似暴發或已確認疫情進行傳染源追蹤 可利用PFGE技術對疑似暴發或已經確定的暴發疫情進行分析，尋找傳染源，控制感染，防止疫情的進一步擴散。新生兒重癥監護病房暴發了無乳鏈球菌引起的感染，Al-Maani 等[8]收集相關臨床菌株并對病房環境進行采樣，同一病房分離的3株臨床菌株和其中一例患者的監控儀按鈕中分離的菌株相同，通過PFGE分型發現4株菌屬于同一型別，可能原因為監控儀按鈕被污染后保潔人員未進行合適的清潔，醫務人員在治療過程中使用監護器，未執行正確手衛生便進行臨床護理；采取相應措施后未出現新發病例。Seara等[9]在西班牙發現7株NDM-7陽性的肺炎克雷伯菌，除粘菌素和磷霉素外對其余抗菌藥物幾乎全部耐藥，PFGE分型為同一型且屬于ST437型，7株菌來自3所醫院，其中3株來自一所醫院同一個病房，在此病房的水槽、淋浴裝置中均檢測到肺炎克雷伯菌，另外2所醫院有2例患者曾在該院住院，可能高齡或患有慢性疾病患者的頻繁轉院，以及菌株在環境中長期存在，導致了NDM-7陽性肺炎克雷伯菌的暴發流行，通過環境干預感染得到控制。2013年6月韓國一所學校暴發了腸黏附性大腸埃希菌(EAEC型)相關的食物中毒，有54例患胃腸炎，對其中22例患者和4名無癥狀廚師的糞便標本分離的大腸埃希菌進行同源性分析，發現PFGE分型相同，可能是廚師污染了食物引起感染的暴發[10]。同年，某醫院暴發一起由洋蔥伯克霍爾德菌引起的感染，產科連續出現剖宮產產婦的手術切口感染，實驗室檢測均確認為洋蔥伯克霍爾德菌,且在B超探頭、三維彩超探頭、普通型醫用超聲耦合劑中檢出PFGE分型相同的洋蔥伯克霍爾德菌，可能是洋蔥伯克霍爾德菌污染了超聲耦合劑，通過直接接觸污染了B超探頭及產婦，同時產婦術前消毒不徹底導致感染的發生[11]。某院同一天上午3例患者先后做白內障手術，術后眼睛均感染銅綠假單胞菌，賈磊等[12]對可能引起感染的環境物體表面、醫療器械、藥物以及洗手用水等進行采樣和細菌培養，利用PFGE技術對從患者和環境中分離的菌株進行同源性分析，發現3例患者分離的銅綠假單胞菌和3處洗手用水分離的菌株分型相同，患者感染的細菌來源于洗手用水。2012年美國發生一起由李斯特菌引起的感染暴發事件，發現是使用某品牌的奶酪引起，對與該品牌奶酪生產相關6個廠家進行環境采樣，有3家檢測到同種菌，且細菌的PFGE分型相似度為100%[13]。韓國一所學校一周內5名學生出現腹瀉，3名學生的直腸拭子中分離到志賀菌，同時從其室友(無臨床癥狀)的直腸拭子也分離到志賀菌，且PFGE分型相同，研究發現，5株志賀菌均攜帶超廣譜β-內酰胺酶基因CTX-M-15，該基因位于質粒IncI1上，可通過接合實驗傳遞給大腸埃希菌J53，耐藥質粒在細菌間轉移可能是導致此次感染暴發的原因[14]。綜上所述，在疑似暴發或感染暴發時，可以收集相關菌株，同時對環境或各個環節進行多次采樣和培養，采用PFGE技術研究菌株的同源性，結合菌株的資料分析，可以鑒定是否為暴發，暴發時有利于發現傳染源，對控制感染暴發的進一步擴大，降低損失有重要意義。

4.3 進行分子流行病學調查研究 Cui等[15]利用PFGE對來自新疆、云南、上海的40株1b型福氏志賀菌進行分型，按82%的相似度分為5型，新疆的菌株分為A、D、E型，云南和上海的菌株分別為B和C型，不同地區的菌株分型不同，同一地區藥敏結果相似的菌株可分為不同亞型。Wu等[16]收集了深圳市人民醫院2002—2009年231株攜帶碳青霉烯酶基因的鮑曼不動桿菌，利用PFGE可分為14型，其中A、J、H型為主要型別，分別占43.3%、 42.0%和8.2%，2008年之前主要以A型為主(OXA-58基因陽性)，2007—2008年以H型(ST 229，OXA-23基因陽性)為主,2009年以J型(ST 381，OXA-23基因陽性)為主。Chen等[17]調查中山大學社區居民和醫務工作者鼻咽部金黃色葡萄球菌定植情況，從589份標本中分離出138株金黃色葡萄球菌，其中4株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),用PFGE對其中129菌進行分型，共分為23型，其中A、N、E、L、O型為主要型別，4株MRSA屬于不同型別。2010年越南南部暴發了霍亂弧菌感染，Nguyen等[18]將與暴發有關的34株菌(來自23例患者，5例接觸者及6株環境分離菌株)和1999—2004年該地區暴發的18株霍亂弧菌菌株進行PFGE分型，發現兩次暴發菌株分型不同，說明兩次暴發不相關。因此，PFGE技術可以對一段時間特定范圍收集的菌株進行同源性分析，結合相關資料研究菌株的時間和地域分布。

4.4 為患者臨床診斷提供實驗室依據 王亞娟等[19]在不同時間內留取一例患兒血培養的2株人葡萄球菌，PFGE分型一致，明確此患兒為新生兒敗血癥，同時另一例患兒血培養的2株表皮葡萄球菌PFGE分型不同，可以協助臨床排除敗血癥。

5 不足之處

在細菌感染性疾病中PFGE在分子分型方面有很多優點，可研究不同菌株的遺傳關系和傳播關系，對研究細菌的流行病學特征有重要作用，但其也有一些不足之處及需要改進的地方，如PFGE儀器及數據分析軟件價格昂貴，一般實驗室難以開展；整個過程耗時長，通常需要2～3 d，分離大片段DNA時可能需要更長的時間；操作者需要較高的技術水平，電泳條件的很小改變就可能影響圖譜中條帶的位置，不同實驗室之間難以標準化；菌株分離后應盡快進行PFGE實驗，防止DNA重排影響結果，實驗中需挑取多個菌落，單一菌落的代表性差[20]；分析條帶的數目和大小，但相同大小的條帶DNA序列不一定相同，可能兩株菌PFGE圖譜相同，但DNA序列不同；酶切位點變化時可能引起不止一個條帶的變化，當一種限制性內切酶分辨率不佳時可同時采用2種或以上限制性內切酶進行分析[21-22], 與其他常用分型方法比較見表1。

表1 幾種常用細菌分型方法的比較

綜上所述，PFGE技術是分子分型技術的“金標準”，PFGE圖譜分析時需與流行病學資料結合進行分析，同時可與其他方法，如MLST結合對細菌進行分型，研究暴發菌株是如何擴散的，以及各細菌群隨時間的變化。基于BioNumerics的數據分析和監測數據庫，2004年我國成立了細菌性傳染病分子分型實驗室監測網絡(PulseNet China)，其采用標準化的細菌分子分型技術，通過各地的網絡實驗室建立網絡平臺及時交流數據進行病原菌的分型監測，在細菌感染性疾病暴發流行的識別、預警中發揮很大作用。隨著系統的完善和各種病原菌PFGE標準化操作規程及數據庫的建立，PFGE技術將會應用更加廣泛。

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(本文編輯：左雙燕)

2016-12-14

湖南省科技計劃項目(2012SK3200)

豆清婭(1987-)，女(漢族)，河南省漯河市人，初級檢驗技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

吳安華 E-mail:dr_wuanhua@sina.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.07.023

R446

A

1671-9638(2017)07-0683-04