清解顆粒揮發(fā)油提取及Box—Behnken優(yōu)化包合工藝研究

唐穎楠 彭穎 唐林 周莉莉 夏新華

摘要：目的 優(yōu)選清解顆粒揮發(fā)油的提取和β-環(huán)糊精包合工藝。方法 采用水蒸餾法進(jìn)行提取，以提取時(shí)間、粉碎度、加水倍數(shù)為考察因素，揮發(fā)油體積為評價(jià)指標(biāo)，考察清解顆粒揮發(fā)油的提取工藝；以包合率為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合，優(yōu)選最佳包合工藝。結(jié)果 優(yōu)選的提取工藝為荊芥、防風(fēng)、連翹藥材粗粉加10倍量水，提取3 h。包合方法為飽和水溶液法，包合工藝為揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比為1∶12、包合溫度40 ℃、包合時(shí)間3.5 h。通過薄層色譜法、紫外光譜法和紅外光譜法初步證明了清解顆粒揮發(fā)油包合物的生成。結(jié)論 優(yōu)化的清解顆粒揮發(fā)油提取和包合工藝穩(wěn)定可行，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：揮發(fā)油；Box-Behnken設(shè)計(jì)；β-環(huán)糊精包合物；提取工藝；包合工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.016

中圖分類號：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0070-06

Extraction Technology of Volatile Oil from Qingjie Granules and Optimization of Inclusion Technology by Box-Behnken TANG Ying-nan1， PENG Ying1， TANG Lin2， ZHOU Li-li1， XIA Xin-hua1 （1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To optimize the extraction of volatile oil from Qingjie Granules and process of inclusion compound of beta-cyclodextrin. Methods Water Distillation was used for extraction. Extraction time， grinding degree， and the amount of water were set as inspection factors， and volatile oil volume was set as the evaluation index to inspect extraction process of volatile oil from Qingjie Granules. With inclusion rate as the evaluation index， the single factor test and the Box-Behnken combined with the response surface method were used to choose the optimum inclusion process. Results The optimum extraction process for Schizonepetae Herba， Saposhnikoviae Radix and Forsythiae Fructus coarse powder should be with 10 times amount of water， extracting 3 h. Inclusion method should be saturated water solution method， and the inclusion process of volatile oil as feed and beta-cyclodextrin inclusion ratio was 1：12； the temperature was 40 ℃； inclusion time was 3.5 h. By means of TLC， UV and IR spectra， the formation of the inclusion compound of volatile oil in clear solution particles was preliminarily proved. Conclusion The optimum extraction and inclusion process of volatile oil from Qingjie Granules are stable and feasible， which can be used in industrial production.

Key words： volatile oil； Box-Behnken design； beta-cyclodextrin inclusion compound； extraction process； inclusion process

清解顆粒為湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院治療急、慢性支氣管炎的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由荊芥、防風(fēng)、連翹、苦杏仁、桔梗等12味藥組成，其中荊芥、防風(fēng)、連翹（青翹）含有較多的揮發(fā)油，與其解熱抗炎、祛痰平喘的藥理作用關(guān)系密切[1]。為減少揮發(fā)油成分對胃腸道黏膜的刺激性，提高藥物的穩(wěn)定性，保證藥物質(zhì)量，我們選用β-環(huán)糊精對清解顆粒中荊芥、防風(fēng)、連翹混合揮發(fā)油進(jìn)行包合，以便開發(fā)為現(xiàn)代中成藥制

通訊作者：夏新華，E-mail：xiaxinhua001@163.com

劑。本試驗(yàn)采用水蒸餾法考察清解顆粒揮發(fā)油提取工藝，并采用飽和水溶液法，單因素試驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法，考察影響包合工藝的主要因素，優(yōu)化清解顆粒揮發(fā)油包合工藝。

1 儀器與試藥

JY5002型電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司），SXKW數(shù)顯控溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），JM-LB50C型膠體磨（溫州市七星乳品場），C-MAG HS4型磁力攪拌器（德國艾卡儀器設(shè)備有限公司），YZF-6030型真空干燥箱（上海姚氏儀器設(shè)備廠），TW-2A單級旋片式真空泵（溫嶺市挺威真空設(shè)備有限公司），101-3A電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），Nicolet iS5紅外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）。

荊芥（批號160110311，產(chǎn)地河北）、連翹（批號160104791，產(chǎn)地山西）、防風(fēng)（批號151209851，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）飲片均購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，符合2015年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。β-環(huán)糊精，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝 選取提取時(shí)間、粉碎度、加水倍數(shù)為考察因素，以揮發(fā)油體積為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選清解顆粒揮發(fā)油提取工藝。①稱取荊芥、防風(fēng)、連翹飲片各80 g，3份，加10倍水，提取7 h；②稱取荊芥、防風(fēng)、連翹飲片及粗粉各80 g，3份，分別加入10倍水，提取7 h；③稱取荊芥、防風(fēng)、連翹粗粉各80 g，3份，加6、8、10、12倍水，提取3 h。按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法甲法操作，收集揮發(fā)油，加入無水硫酸鈉脫水，讀取揮發(fā)油量。結(jié)果7 h的揮發(fā)油提取量為1.20 mL，全飲片直接提取揮發(fā)油耗時(shí)長、提取量少。粗粉的揮發(fā)油提取量為1.60 mL，明顯高于飲片；當(dāng)粗粉提取3 h后，揮發(fā)油基本提取完全；10倍量水提取揮發(fā)油時(shí)，揮發(fā)油提取量達(dá)到最大，為1.61 mL。最佳提取工藝為：荊芥、防風(fēng)、連翹粗粉加10倍量水，加熱蒸餾提取3 h，收集揮發(fā)油。

2.1.2 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取荊芥、防風(fēng)、連翹粗粉各80 g，共3份，按上述優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，并記錄揮發(fā)油提取量。結(jié)果顯示，3批飲片揮發(fā)油平均提取量為1.62 mL，RSD=1.79%，表明揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 揮發(fā)油包合方法選擇和包合工藝評價(jià)指標(biāo)測定

2.2.1 包合方法比較

2.2.1.1 飽和水溶液法 精密稱定β-環(huán)糊精10 g，置于錐形瓶中，加水150 mL，并于溫度設(shè)為40 ℃的磁力攪拌器上攪拌均勻，緩緩加入1 mL揮發(fā)油（預(yù)先配成50%無水乙醇溶液），恒溫?cái)嚢? h，放冷至室溫，置冰箱冷藏24 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，45 ℃真空干燥5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算包合物收率[包合物質(zhì)量÷（β-環(huán)糊精投入量+揮發(fā)油投入量）×100%]。

2.2.1.2 膠體磨法 精密稱定β-環(huán)糊精30 g，置于燒杯中，加8倍量水，使其混勻后倒入膠體磨中進(jìn)行擠壓包合。5 min后緩緩加入揮發(fā)油3 mL（預(yù)先配成50%無水乙醇溶液），研磨30 min，置冰箱冷藏24 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，45 ℃真空干燥5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算包合物收率。

2.2.2 包合工藝評價(jià)指標(biāo)測定 取清解顆粒揮發(fā)油包合物置于圓底燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油提取器，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄揮發(fā)油測定法項(xiàng)甲法讀取揮發(fā)油提取量。另精密量取清解顆粒揮發(fā)油1 mL，同法操作，讀取清解顆粒揮發(fā)油回收量。計(jì)算空白回收率（揮發(fā)油回收量÷?lián)]發(fā)油加入量×100%）和揮發(fā)油包合率（包合物實(shí)際收油量÷?lián)]發(fā)油加入量÷空白回收率×100%），平行3份。結(jié)果顯示，揮發(fā)油空白回收率為90%，采用飽和水溶液法和膠體磨法所得的揮發(fā)油平均包合率分別為88.89%和54.94%。可見，飽和水溶液法的揮發(fā)油包合率高于膠體磨法，故選擇飽和水溶液法用于包合揮發(fā)油。

2.3 揮發(fā)油包合工藝單因素試驗(yàn)考察

2.3.1 揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比 按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法制備包合物，固定包合溫度為40 ℃、包合時(shí)間為3 h、乙醇用量為1 mL、冷藏時(shí)間為24 h，考察清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，mL∶g），重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，β-環(huán)糊精用量對包合物收率影響不明顯，但對揮發(fā)油包合率影響顯著。清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比在1∶6～1∶12時(shí)，隨著β-環(huán)糊精投料量增加，揮發(fā)油包合率也逐漸增加（見圖1）。因此，選擇清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶10～1∶14進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最優(yōu)的清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例。

2.3.2 包合溫度 按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法制備包合物，固定荊清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶10、包合時(shí)間為3 h、乙醇用量為1 mL、冷藏時(shí)間為24 h，考察包合溫度（30、40、50、60 ℃），重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，包合溫度對包合物收率影響不大，但對揮發(fā)油包合率影響顯著。隨著包合時(shí)間增加，揮發(fā)油包合率先逐漸增大后減小，包合溫度為40 ℃時(shí)揮發(fā)油包合率較大（見圖2），可能由于隨著包合溫度的升高，部分揮發(fā)油揮發(fā)，導(dǎo)致包合率下降。因此，選擇包合溫度為30～50 ℃進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最優(yōu)的清解顆粒揮發(fā)油包合溫度。

2.3.3 包合時(shí)間 按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法制備包合物，固定清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶10、包合溫度為40 ℃、乙醇用量為1 mL、冷藏時(shí)間為24 h，考察包合時(shí)間（1、2、3、4 h），重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，包合時(shí)間對包合物收率影響不大，但對揮發(fā)油包合率影響顯著。隨著包合時(shí)間的增加，揮發(fā)油包合率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；包合時(shí)間為3 h時(shí)，揮發(fā)油包合率高于其他3個(gè)試驗(yàn)水平（見圖3）。因此，選擇包合時(shí)間為2～4 h進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化，以確定最優(yōu)的包合時(shí)間。

2.3.4 乙醇用量 按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法制備包合物，固定清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶10、包合溫度為40 ℃、包合時(shí)間3 h、冷藏時(shí)間為24 h，考察乙醇用量（1、2、3、4 mL），重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，隨著乙醇用量的增加，包合物收率和揮發(fā)油包合率均無明顯變化的趨勢（見圖4）。基于節(jié)約溶劑的考慮，選擇乙醇用量為1 mL。

2.3.5 冷藏時(shí)間 按“2.2.1.1”項(xiàng)下方法制備包合物，固定清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶10、包合溫度為40 ℃、包合時(shí)間3 h、乙醇用量為1 mL，考察冷藏時(shí)間（3、6、12、24 h），重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，隨著包合時(shí)間的增加，包合物收率緩慢增加，揮發(fā)油包合率先增加，6 h后趨于穩(wěn)定（見圖5）。基于節(jié)約時(shí)間考慮，選擇冷藏時(shí)間為6 h。

2.4 Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面分析法優(yōu)選包合物制備工藝

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（3個(gè)零點(diǎn)）的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比（A）、包合溫度（B）、包合時(shí)間（C）為考察因素，揮發(fā)油包合率為響應(yīng)值，優(yōu)化清解顆粒揮發(fā)油的包合工藝。Box-Behnken響應(yīng)面的因素水平設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1。

2.4.1 包合物的制備及包合率測定 按Box-Behnken設(shè)計(jì)安排進(jìn)行試驗(yàn)，取一定量β-環(huán)糊精，置于錐形瓶中，加水150 mL，并于相應(yīng)溫度的磁力攪拌器上攪拌均勻，緩緩加入1 mL揮發(fā)油（預(yù)先配成50%無水乙醇溶液），恒溫?cái)嚢柚烈?guī)定時(shí)間，放冷至室溫，置冰箱冷藏6 h，抽濾，包合物用少量水洗滌，45 ℃真空干燥5 h。取包合物置于圓底燒瓶中，加水適量，連接揮發(fā)油提取器，按2015年版《中華人民共和國藥典》（四部）附錄揮發(fā)油測定法甲法讀取揮發(fā)油提取量，并計(jì)算揮發(fā)油包合率。

2.4.2 模型擬合與方差分析 利用Design-Expert10.0.3統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，并獲得揮發(fā)油包合率對自變量A、B、C的多元線性回歸方程、二項(xiàng)式擬合方程。多元線性回歸方程：Y=85.19+2.92A+1.11B+4.30C，P=0.122 5，r=0.627 6。二項(xiàng)式擬合方程：Y=93.70+2.92A+1.11B+4.30C+1.67AB-1.39AC+0.55BC-6.15A2-5.88B2-3.93C2，P=0.025 4，r=0.960 6。

通過P值及相關(guān)系數(shù)（r）判定以上回歸方程的擬合情況。多元線性回歸方程P>0.05，表明建立的模型不具顯著性；r較低，可知自變量與因變量之間的線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳、預(yù)測性較差，因此多元線性回歸擬合模型不適合。二項(xiàng)式擬合方程P<0.05，r=0.960 6，表明該模型擬合度高、預(yù)測性較好，故選擇二項(xiàng)式擬合模型為最佳模型。由二項(xiàng)式擬合方程可知，影響揮發(fā)油包合率的因素順序?yàn)榘蠒r(shí)間>揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比>包合溫度。采用ANOVA方差分析分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，結(jié)果見表2。

方差分析結(jié)果顯示，該二項(xiàng)式擬合模型F=6.64，P<0.05，表明模型具有顯著性；決定系數(shù)R2=0.922 7，表明方程的因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的。模型的變異系數(shù)為3.50%，說明該模型的精密度良好。同時(shí)，方程的失擬項(xiàng)F=8.33，P>0.05，表示失擬項(xiàng)不顯著，說明回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)的擬合情況良好，可用該回歸模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對結(jié)果進(jìn)行分析。

2.4.3 響應(yīng)面圖分析 各因素對揮發(fā)油包合率影響的三維響應(yīng)面圖見圖6。

根據(jù)Design-Expert10.0.3軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出清解顆粒揮發(fā)油-β-環(huán)糊精的最佳包合工藝參數(shù)：清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶12.396、包合時(shí)間3.522 h、包合溫度41.467 ℃。對此工藝下清解顆粒揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物的揮發(fā)油包合率進(jìn)行預(yù)測，理論值為95.195%。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)條件對工藝參數(shù)進(jìn)行修正，最終得到清解顆粒揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合工藝條件為：清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶12、包合時(shí)間3.5 h、包合溫度40 ℃。

2.4.4 包合工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)化后的最終包合工藝條件和“2.4.1”項(xiàng)下包合物的制備方法對清解顆粒揮發(fā)油進(jìn)行包合，平行操作3次，結(jié)果揮發(fā)油包合率依次為95.56%、92.22%、97.78%，均值為95.19%，RSD=2.94%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，揮發(fā)油包合率基本穩(wěn)定，其均值與理論預(yù)測值的相對誤差很小，證明了包合工藝的合理性和可行性。

2.5 揮發(fā)油包合物的鑒別

2.5.1 薄層色譜鑒別 取未包合的揮發(fā)油5滴，加入1 mL無水乙醇中，制成樣品1；取β-環(huán)糊精0.1 g，加入1 mL無水乙醇中，振搖5 min，過濾，制成樣品2；取揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物0.1 g，加入1 mL無水乙醇，振搖5 min，過濾，制成樣品3；取從包合物中回收的揮發(fā)油5滴，加入1 mL無水乙醇中，制成樣品4。吸取樣品1～4，分別點(diǎn)樣于硅膠薄層板（105 ℃活化30 min），以醋酸乙酯-正己烷-氯仿（1∶11∶3）為展開劑展開，待展開劑上行12 cm后，取出，晾干，噴5%香草醛-硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰可見。結(jié)果顯示，樣品1、4的斑點(diǎn)完全一致，說明包合前后揮發(fā)油的主要成分無明顯差異；同時(shí)，在揮發(fā)油的斑點(diǎn)對應(yīng)處，樣品2、3未見斑點(diǎn)，說明包合物已將揮發(fā)油包合。

2.5.2 紫外光譜鑒別 分別取少量未包合的揮發(fā)油、包合物回收揮發(fā)油、揮發(fā)油包合物和β-環(huán)糊精，以無水乙醇溶解，置于紫外可見分光光度計(jì)上，于200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，測定吸光度。結(jié)果揮發(fā)油和包合物回收揮發(fā)油的紫外可見吸收圖譜無明顯差異，而包合物與揮發(fā)油和β-環(huán)糊精的紫外可見吸收圖譜有顯著差異，說明包合物已將揮發(fā)油包合，而且包合前后其理化性質(zhì)沒有發(fā)生變化，見圖7。

2.5.3 紅外光譜鑒別 將β-環(huán)糊精、揮發(fā)油和揮發(fā)油包合物（經(jīng)石油醚洗滌）樣品分別采用KBr壓片法制備供試品，對3個(gè)供試品分別進(jìn)行紅外光譜掃描。測定條件：掃描范圍4 000～570 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)30次。測定結(jié)果見圖8。可見，在1500～800 cm-1，β-環(huán)糊精和包合物均出現(xiàn)1個(gè)吸收峰，但包合物吸收程度弱于β-環(huán)糊精；在800～570 cm-1，揮發(fā)油有多個(gè)吸收峰，β-環(huán)糊精和包合物吸收峰均不明顯，說明包合物已將揮發(fā)油包合。

3 討論

在單因素試驗(yàn)考察中，本研究不僅考察了常見影響揮發(fā)油包合的因素（揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比、包合溫度、包合時(shí)間），還考察了乙醇用量和冷藏時(shí)間，結(jié)果表明乙醇用量和冷藏時(shí)間對揮發(fā)油包合率影響不大。

在揮發(fā)油包合工藝中，揮發(fā)油包合率、包合物收率、含油率通常作為工藝的評價(jià)指標(biāo)，其中揮發(fā)油包合率是其中最直接也是最準(zhǔn)確的評價(jià)方法[2-5]。在單因素考察中可以明顯看出，包合物收率隨各因素水平變化較小，故包合物收率不列為評價(jià)指標(biāo)。

Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)是響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法中的一種，適合于用非線性模型擬合[6-7]。與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，此方法增加了考察水平，使結(jié)果更加直觀，且具有精確分析出因素區(qū)域內(nèi)最佳點(diǎn)的優(yōu)勢。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用Box-Behnken響應(yīng)面法，考察清解顆粒揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比、包合溫度、包合時(shí)間對清解顆粒揮發(fā)油包合率的影響，最終得到揮發(fā)油最佳包合工藝條件為：荊芥、連翹、防風(fēng)混合揮發(fā)油與β-環(huán)糊精投料比為1∶12，包合溫度為40 ℃，包合時(shí)間為3 h。同時(shí)，本試驗(yàn)選用薄層色譜法、紫外光譜法和紅外光譜法對清解顆粒揮發(fā)油包合物進(jìn)行鑒別，初步驗(yàn)證了清解顆粒揮發(fā)油包合物的形成。

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（收稿日期：2016-11-21）

（修回日期：2016-12-06；編輯：陳靜）