蕨麻多糖提取純化及生物活性研究進(jìn)展

沈蓉，劉迪生，侯晨晨，劉迪，程菊，白德成

1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

蕨麻多糖提取純化及生物活性研究進(jìn)展

沈蓉1，劉迪生2，侯晨晨1，劉迪1，程菊1，白德成1

1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

蕨麻為傳統(tǒng)中藥，且為藏醫(yī)常用草藥，主要分布于我國甘肅、青海、西藏等地。蕨麻多糖是蕨麻的多種活性成分之一，近年來國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了初步研究，顯示其具有抗氧化、抗衰老、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖等多種功效。本文對近年蕨麻多糖的提取、純化、生物活性研究進(jìn)行綜述，為深入研究及開發(fā)利用提供思路。

蕨麻多糖；提取；純化；生物活性；綜述

蕨麻為薔薇科植物鵝絨委陵菜屬植物蕨麻Potentilla anserina L.的塊根。藏名又稱戳瑪、卓老灑曾、延壽草、仙人果等。主要產(chǎn)于我國華北、東北和西北等地，遍布于海拔500～4100 m山坡草地及草甸。《新華本草綱要》載青藏高原產(chǎn)蕨麻塊根發(fā)育最良。蕨麻因根塊膨大、富含淀粉，產(chǎn)地居民常將其用于日常飲食，認(rèn)為具有滋補(bǔ)作用，食之益人。蕨麻性甘、味溫，可養(yǎng)陰生津、益胃健脾、益補(bǔ)血?dú)猓嬷寡⒅篂a、止咳功效，能治婦人崩中、下血、吐血、癰瘡瘧疾、脾虛腹瀉、下痢等[1]。藏醫(yī)學(xué)著作《月王藥診》載治“小腸出血，干燥，粘連胃壁，眼不閉合之癥”；《四部醫(yī)典》亦記載蕨麻治療出血癥及脾胃虛弱等疾病。近年來，蕨麻在中醫(yī)臨床上也有廣泛應(yīng)用，如治療狼瘡性腎炎、慢性腎功能衰竭、大病初愈身體虛弱等。因此，蕨麻具有較高的食用和藥用價(jià)值。

蕨麻含有多種化學(xué)成分，如多糖、萜類、酚類、黃酮類等[2-4]，其中蕨麻多糖具有明確的生物學(xué)活性，可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗菌等多方面的藥理作用。本文就蕨麻多糖的提取、純化及其生物活性進(jìn)行整理，為蕨麻開發(fā)利用及后續(xù)研究提供參考。

1 提取工藝

蕨麻多糖有多種提取方法，一般用水、稀鹽或稀堿溶液提取得到粗多糖，酸性條件下溫度過高易引起糖苷鍵斷裂，故也可采用復(fù)合酶熱水浸提法。

常見提取方法為水提醇沉法。將蕨麻粉碎，石油醚等有機(jī)溶劑脫脂，按一定液料比加入蒸餾水，沸水浴中提取一段時(shí)間，取上清液加入乙醇或甲醇沉淀，過夜后離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥，制得蕨麻粗多糖。此方法將溫度、時(shí)間、料液比作為單因素條件，分別測定不同條件下蕨麻多糖的提取率，以確定適合蕨麻多糖提取的最佳工藝條件。通過3種單因素正交試驗(yàn)和極差分析，提取溫度為 90 ℃，時(shí)間為 1 h，料液比為 1∶15，多糖的提取率為 5.72%±0.37%[5]。該方法 3 種因素中料液比對提取率影響最大，其次是時(shí)間、溫度，故選擇適宜的料液比至關(guān)重要。隨著料液比的提高，多糖得率出現(xiàn)先升后降的現(xiàn)象；隨著溫度的升高，多糖向提取液的傳質(zhì)速率增加，黏度逐漸降低，有利于組織中多糖浸出，但溫度過高會導(dǎo)致多糖降解甚至失活。因此，采用不同的方法所得到的多糖濃度及組分也有差異。

丁耀光等[6]利用索氏提取法和超聲波輔助提取法提取蕨麻粗多糖后純化，苯酚-硫酸法測定多糖含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，索氏提取法多糖含量為14.34 mg/g，超聲波輔助提取法蕨麻多糖含量高達(dá)24.25 mg/g。

王峰等[7]以水為溶劑，微波輔助提取蕨麻多糖，得到最佳工藝條件為液固比 3、浸提溫度 90 ℃、浸提時(shí)間 120 min，Sevage 法除蛋白后蕨麻多糖平均含量可達(dá) 83.9 mg/kg。

高丹丹等[8]建立了蕨麻多糖的提取率數(shù)學(xué)模型，用 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化提取工藝。采用水提醇沉法提取蕨麻粗多糖，以丙酮、乙醚除去雜質(zhì)，分析多糖的最佳提取調(diào)件為液料比（m L/g）20.3∶1、浸提時(shí)間 4.4 h、溫度 82 ℃，蕨麻多糖提取率可達(dá) 24.53%±0.24%。

陳煉紅等[9]用復(fù)合酶水解法提取蕨麻多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對復(fù)合酶配比和提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶三種酶的最佳酶配比及酶解時(shí)間為 60 m in，復(fù)合酶法提取法的優(yōu)化工藝條件為料液比 1∶30、pH 值 4.5、溫度 45 ℃，蕨麻多糖得率為 8.12%，優(yōu)于常規(guī)水提法。

2 純化工藝

提取得到的蕨麻粗多糖為多種單糖、蛋白質(zhì)、色素等的混合物，雜質(zhì)存在增加了多糖的吸濕性，其所帶電荷可吸附大量其他雜質(zhì)，使雜質(zhì)去除變得更為困難。此外，蛋白質(zhì)吸附多糖，增加了多糖的分級、分離難度。故不能以通常化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來衡量，需經(jīng)純化、分離才能得到一定分子量范圍的均一組分即純品多糖。

脫蛋白主要方法有酶法、Sevage 法、酶法＋Sevage 法。酶法根據(jù)酶解時(shí)間、pH 值、酶用量、酶解溫度4個(gè)單因素確定工藝條件，以脫蛋白率和多糖提取率為主要評價(jià)指標(biāo)。該法符合對多糖組成、結(jié)構(gòu)、功能的研究需要，操作條件較平穩(wěn)，能較好保持多糖活性，避免使用有機(jī)試劑產(chǎn)生的危害。Sevage 法是在蕨麻粗多糖溶液中，加一定體積 Sevage 試劑（氯仿與正丁醇按一定比例混合），充分混勻后靜置一段時(shí)間，于分液漏斗中分層后棄去下層有機(jī)溶劑層及中間的蛋白質(zhì)層。需反復(fù)多次方能達(dá)到較好的脫蛋白質(zhì)效果，故除單因素外，還需考慮次數(shù)對脫蛋白效果的影響。該法以蛋白質(zhì)的去除率為主要評價(jià)指標(biāo)，較好的脫蛋白工藝為靜置 10 m in、搖振 30 m in、氯仿∶正丁醇（V/V）5∶1、料液比 1∶1[10]。酶法＋Sevage 法是使用最優(yōu)方案酶法和 Sevage 法相結(jié)合的脫蛋白法，在蛋白酶最佳工藝條件下，可提高蕨麻多糖脫蛋白率、降低損失率。

純化的蕨麻多糖呈白色，但因提取方法缺陷和植物組織成分復(fù)雜性，提取的蕨麻多糖液多呈褐色、黃色或紅色，對其分離、純化、定量、定性、結(jié)構(gòu)測定、藥效實(shí)驗(yàn)均有較大影響。因此，脫色在蕨麻多糖純化過程中也十分重要。常用脫色方法有活性炭法和樹脂吸附法。活性炭可吸附芳香族有機(jī)物，對不帶電荷的物質(zhì)吸附力較強(qiáng)，而對帶電荷的物質(zhì)吸附力較弱；樹脂吸附法采用的樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，不受鹽類及低分子化合物的影響，可有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)。

純化后的蕨麻多糖由多種單糖成分組成，可用超離心、高壓電泳、層析及高效液相色譜法等分析各組分。劉春蘭等[11]采用水提法提取蕨麻粗多糖后，以酶法脫淀粉及蛋白，經(jīng)紙層析及高效液相色譜分析，得出蕨麻多糖組分包括阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，為酸性雜多糖。夏蓮等[12]用毛細(xì)管電泳分析法，以 1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮作柱前衍生劑，水提醇沉并經(jīng) Savage 法脫蛋白后，從蕨麻多糖中精細(xì)分離出9種單糖組分，其中阿拉伯糖、半乳糖及半乳糖醛酸含量最高，其次為葡萄糖、鼠李糖及葡萄糖醛酸，木糖、甘露糖及巖藻糖含量較低。

3 生物活性

中藥的多糖成分作為中藥新藥開發(fā)的重要方向之一，受到學(xué)者關(guān)注，其生物活性及藥理作用機(jī)制也成為研究熱點(diǎn)。蕨麻多糖生物活性主要體現(xiàn)在抗氧化應(yīng)激、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等方面。

3.1 抗氧化及衰老

蕨麻多糖可通過清除 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羥自由基對抗氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧及自由基水平，從而抑制細(xì)胞凋亡[13]。采用必需微量元素硒修飾蕨麻多糖，硒化修飾的蕨麻多糖體外抗氧化能力及自由基清除率可顯著提高[14]。

韋薇等[15]建立新生 SD 鼠心肌細(xì)胞缺氧損傷模型，觀察不同濃度蕨麻多糖對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用；建立小鼠常壓缺氧模型，予不同濃度蕨麻多糖灌胃。結(jié)果表明，蕨麻多糖能明顯降低心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出、改善心肌細(xì)胞活力可提高缺氧小鼠存活率、延長生存時(shí)間。

張永慧等[16]建立大鼠腦缺血再灌注模型，術(shù)前連續(xù)予蕨麻多糖 7 d。結(jié)果表明，蕨麻多糖能明顯改善缺血再灌注引起的神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失、降低腦組織炎癥因子丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子-α 及白細(xì)胞介素（IL）-1β 含量，提高腦組織抗氧化能力。

研究表明，予蕨麻多糖后采用過氧化氫誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，能明顯改善脾淋巴細(xì)胞氧化損傷、減少細(xì)胞內(nèi)凋亡小體形成，在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性[17]。低濃度蕨麻水提物可呈劑量依賴性清除DPPH 自由基，抑制肌纖維細(xì)胞 IL-6 產(chǎn)生，對細(xì)胞骨架纖維肌動蛋白及人結(jié)腸細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)均有一定的調(diào)節(jié)作用[18]。此外，蕨麻水提取物可增加小鼠腦、肝及血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低 MDA 水平，提高腦內(nèi) Na+-K+-ATP酶水平，延緩 D-半乳糖所致衰老，改善學(xué)習(xí)記憶能力[19]。

3.2 調(diào)節(jié)免疫

免疫系統(tǒng)具有重要的防御屏障作用，免疫功能低下將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性下降、易感性增加。用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo) BALB/c 小鼠免疫抑制模型，予蕨麻多糖連續(xù)預(yù)處理 5 d 再予環(huán)磷酰胺，可緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠胸腺及脾臟組織萎縮，改善免疫抑制劑對組織超微結(jié)構(gòu)的影響，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，活化單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，刺激吞噬細(xì)胞吞噬功能的發(fā)揮，改善血清炎癥因子 IL-10、干擾素-γ（IFN-γ）水平，顯著提高免疫抑制小鼠的免疫功能[20-21]。不同濃度的蕨麻多糖可改善急性低劑量鎘染毒小鼠的脾、胸腺指數(shù)，增加 CD3+、CD4+的脾淋巴細(xì)胞數(shù)目，促進(jìn)鎘染毒小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ及可溶性淋巴細(xì)胞活化基因-3[22]。體外實(shí)驗(yàn)表明，蕨麻多糖可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶提高小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷水平，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，還可升高細(xì)胞內(nèi) Ca2+水平、影響蛋白激酶C信號通路、活化淋巴細(xì)胞，對細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸信號分子的表達(dá)亦有調(diào)節(jié)作用[23]。此外，蕨麻多糖可提高大鼠運(yùn)動能力，抑制運(yùn)動性免疫機(jī)能低下的發(fā)生，加速運(yùn)動后的機(jī)體恢復(fù)[24]。因此，蕨麻多糖對機(jī)體的免疫功能具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

3.3 抗菌

蕨麻多糖的抗菌作用屢有報(bào)道。Tomczyk M 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，蕨麻水提物對幽門螺旋桿菌有明顯的抑制作用，且對革蘭氏陽性菌（藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）也有一定的抑制作用，但對革蘭氏陰性菌無明顯抑制作用。郝博慧[5]研究表明，0.5%蕨麻多糖可抑制志賀菌，抑制時(shí)間可達(dá) 24 h，1%、3%蕨麻多糖可分別抑制大腸桿菌和沙門氏菌，抑制時(shí)間可達(dá) 8 h。此外，蕨麻水提物對 6 種食品污染菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、志賀菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌）均有一定的抑制作

用[26-27]。

3.4 調(diào)節(jié)血糖

研究表明，蕨麻多糖具有伏格列波糖、阿卡波糖樣作用，可抑制 α-葡萄糖苷酶的純酶活性，提示可能具有延緩單糖吸收、降低餐后高血糖的作用[28]。夏勇等[29]連續(xù)予四氧嘧啶高血糖模型小鼠蕨麻及麥冬混合水提物（劑量為 3 g/kg）30 d，模型組空腹血糖明顯改善，且糖耐量隨提取物劑量增加呈增高的趨勢，提示蕨麻及麥冬混合提取多糖對高血糖小鼠血糖有調(diào)節(jié)作用。

3.5 其他

此外，蕨麻多糖可改善四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷，明顯降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，改善肝功能、降低肝臟的脂質(zhì)過氧化[30]。

陳修紅等[27]研究表明，蕨麻水提物除抑菌作用外還可明顯抑制人肝癌細(xì)胞 HepG2 的活性及體外增殖，提示可能具有潛在的抗腫瘤活性。

Guo T 等[31]研究表明，蕨麻多糖具有鎮(zhèn)咳祛痰的作用，可降低化學(xué)刺激引起的小鼠氣道痙攣，減少咳嗽頻率。

4 展望

隨著對蕨麻研究的深入，蕨麻多糖的成分及生物活性已逐漸成為研究熱點(diǎn)。蕨麻多糖因其多種生物活性，具有廣闊的研究和開發(fā)前景。目前，蕨麻提取及生物活性相關(guān)研究較多，但多運(yùn)用蕨麻提取物的混合組分，該類混合物除多糖外，還含有萜類、黃酮類、酚類等多種成分，故不能說明蕨麻多糖作用；此外，蕨麻多糖具體有效成分及其作用機(jī)制尚不明確；同時(shí)，由于原材料及提取方法等方面的局限性，蕨麻多糖的化學(xué)成分存在差異，尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化研究。因此，為充分開發(fā)蕨麻多糖藥用價(jià)值，其研究還有待于進(jìn)一步深入。

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Research Progress in Extraction, Purification and Bioactivities of Potentilla Anserine Polysaccharide

SHEN Rong1, LIU Di-sheng2, HOU Chen-chen1, LIU Di1, CHENG Ju1, BAI De-cheng1(1. School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2. The First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

As a common Tibetan medicine, Potentilla anserine L. is a kind of important Chinese materia medica, which is mainly distributed in Gansu, Qinghai and Tibet Provinces. As the active constituent from Potentilla anserine L., potentilla anserine polysaccharide has

initial research by researchers in abroad and at home. It is suggested that potentilla anserine polysaccharide exhibits various functions including antioxidation, anti-aging, immunoregulation, inhibiting bacteria and anti-diabetic. This article reviewed the research on extraction, purification and bioactivities of potentilla anserine polysaccharide, which is expected to provide ideas for the further study and research and development.

potentilla anserine polysaccharide; extraction; purification; bioactivities; review

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.031

R284.2；R285.5

A

1005-5304(2017)08-0125-04

2016-06-27）

（

2016-07-15；編輯：向宇雁）

甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金（1205FCCA27）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（lzujbky-2016-61）

白德成，E-mail：bdc@lzu.edu.cn