蘇木、川芎對PG—BE1干細胞樣細胞標志蛋白ABCG2影響的體內研究

王耀焓 張培彤 楊棟 韓海英 郭秀偉 祁鑫 張蕓

摘要：目的 體內實驗觀察不同劑量蘇木、川芎對腫瘤干細胞樣細胞標志物ABCG2的影響。方法 將無血清培養獲得的球細胞接種于裸鼠腋下，將裸鼠隨機分為對照組、蘇木高劑量組、蘇木低劑量組、川芎高劑量組和川芎低劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃，21 d后檢測抑瘤率，激光共聚焦、Western blot和RT-PCR分別檢測瘤體ABCG2蛋白和mRNA表達。結果 經無血清培養獲得的球細胞具有無限增殖、抗凋亡、高表達干細胞標志物等干細胞性能，川芎高、低劑量組可明顯抑制瘤體生長（P<0.05），其中川芎低劑量組抑瘤率明顯高于川芎高劑量組，蘇木高、低劑量組雖對瘤體有一定的抑制作用，但差異無統計學意義（P>0.05）；與對照組比較，川芎低劑量組可明顯抑制ABCG2蛋白的表達，蘇木高、低劑量組對ABCG2蛋白表達均無抑制作用，除川芎低劑量組外，各給藥組對ABCG2 mRNA表達均有上調作用。結論 低劑量川芎可能通過抑制腫瘤干細胞標志物ABCG2蛋白的表達，靶向殺傷腫瘤干細胞。

關鍵詞：蘇木；川芎；腫瘤干細胞；ABCG2蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0060-06

Effects of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on Expression of ABCG2 Protein of PG-BE1 Stem Like Cells in Vivo WANG Yao-han， ZHANG Pei-tong， YANG Dong， HAN Hai-ying， GUO Xiu-wei， QI Xin， ZHANG Yun （Department of Oncology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract： Objective To observe the effects of different doses of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on tumor stem cells marker ABCG2 in vivo. Methods Sphere cells obtained from serum culture were inoculated in nude mouse armpit， which were randomly divided into 5 groups： control group， Sappan Lignum high- and low-dose groups， and Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. 21 days later， inhibition tumor rate and ABCG2 protein and mRNA expression were detected with confocal microscope， Western blot， and RT-PCR. Results The sphere cells obtained from serum free culture had the abilities of cancer stem cells， such as proliferation， anti-aptosis and high expression of cancer stem cells markers. Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups could inhibit tumor growth （P<0.05）， and the inhibitory rate of Chuanxiong Rhizoma low-dose group was higher than the Chuanxiong Rhizoma high-dose group. Sappan Lignum high- and low-dose groups inhibited tumor growth without statistical significiance （P>0.05）. Compared with the control group， Chuanxiong Rhizoma low-dose group could significantly inhibit the expression of resistant protein of ABCG2. Sappan Lignum high- and low-dose groups could not inhibit the protein expression of ABCG2. Each medication group up-regulated the mRNA expression of ABCG2 except for Chuanxiong Rhizoma low-dose group. Conclusion Low dose of Chuanxiong Rhizoma can inhibit the expression of ABCG2 protein levels， which can be the targeting killer for cancer stem cells.

Key words： Sappan Lignum； Chuanxiong Rhizoma； cancer stem cells； ABCG2 protein

基金項目：國家自然科學基金（81173450）

通訊作者：張培彤，E-mail：zhangpeitong@sohu.com

化療在改善腫瘤患者生存質量、提高患者生存率方面起到重要作用。然而，化療耐藥的存在一直制約著臨床療效的發揮。有研究顯示，經化療后再復發或發生遠處轉移的乳腺癌患者，大約40%是由于化療耐藥引起的[1]。因此，尋找可以增強化療敏感性的藥物是目前面臨的挑戰。近幾年來，腫瘤干細胞理論的提出對化療耐藥的治療提出了新的理念。該理論認為，腫瘤干細胞具有自我更新、多向分化、化療耐藥等性能，是腫瘤復發及轉移的主要原因。課題組前期研究表明，蘇木、川芎嗪對腫瘤轉移具有明顯的抑制作用[2-3]。體內實驗顯示，蘇木、雞血藤及二者聯合順鉑可以將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，并可抑制與細胞增殖相關的蛋白增殖細胞核抗原（PCNA）、低氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達，另外對P16-Cyclin D1- CDK4-RB途徑也具有調節作用，三者相互作用共同阻滯腫瘤的發生發展[4-5]。基于以上研究基礎，我們選用川芎、蘇木作為活血的代表藥，體內實驗觀察不同劑量蘇木、川芎對肺癌干細胞樣細胞的干預作用。ABCG2蛋白是目前比較公認的腫瘤干細胞標志物之一。因此，本實驗主要研究在體內環境中不同劑量川芎、蘇木對PG-BE1干細胞樣細胞標志蛋白ABCG2的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，體質量（16±2）g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SYXK（京）2013-0032，飼養于北京大學醫學部實驗動物中心。

1.2 細胞系

高轉移性人巨細胞肺癌細胞PG-BE1，中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤研究室。

1.3 藥物

蘇木、川芎，康美藥業股份有限公司；順鉑注射液，齊魯制藥（海南）有限公司，批號20120724。

1.4 主要試劑與儀器

Human FGF-basic（美國Pero Tech），Human EGF（美國Pero Tech），B27 Supplement（50×，美國Gibco），Tripsin inhibition from Glycine max（soybea，美國Sigma），Anti-BCRP/ABCG2抗體（美國Abcam），CCK8試劑盒（日本同人），ANNEXIN V（美國BD），ABCG2 Gene、Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）、TRIzol Reagent（美國Life Technologies）。高速冷凍離心機（美國Sigma），NanoDrop 2000超微量分光光度計（美國Thermo Scientific），PROGENE PCR擴增儀（英國Techene），Applied Biosysterns 7500 RT-PCR Systems（美國ABI），DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠），ChemiDoc XRS凝膠成像系統（美國Bio-Rad），ZEISS LSM710激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss），水平電泳槽（美國Bio-Rad）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備、分組及給藥

取蘇木、川芎各15 g，雙蒸水浸泡30 min，煎煮2次，將2次煎劑濃縮至60 mL，濃度0.25 g/mL，為高劑量藥液。另取蘇木、川芎各5 g，雙蒸水浸泡30 min，將2次煎劑濃縮至100 mL，濃度0.05 g/mL，為低劑量4 ℃冰箱保存備用。將裸鼠隨機分為對照組、川芎低劑量組、川芎高劑量組、蘇木高劑量組、蘇木低劑量組，每組5只，蘇木低、高劑量和川芎低、高劑量小鼠給藥劑量相當于成人（體質量60 kg）臨床給藥量10、30倍（成人每日臨床給藥量為蘇木、川芎各10 g）。小鼠給藥體積為200 μL/次，1次/d。

2.2 干細胞樣細胞分選

常規復蘇、培養PG-BE1細胞，待其生長至70%～80%時，胰酶消化成單個細胞，PBS清洗2次，重懸于含0.02 μg/mL EGF、0.02 μg/mL bFGF、5 μg/mL胰島素、2%B27、4%BSA的DMEM/F-12的培養基，調整細胞濃度2×104/孔，接種于低黏附6孔板，待細胞成球且折光率變低時收集PG-BE1球細胞，離心、胰酶消化，1 mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，重懸于上述完全培養基DMEM/F-12中。使用傳代至第3代的PG-BE1球細胞。

2.3 干細胞樣細胞鑒定

2.3.1 CCK-8檢測細胞增殖 分別收集PG-BE1貼壁細胞及第3代PG-BE1球細胞，接種于96孔板，1000個/孔，分為3、4、5、6、7 d組，每組5個復孔。分別于第3、4、5、6、7日時加入Cell Counting Kit-8細胞增殖檢測試劑，10 μL/100 μL培養基，酶標儀檢測吸光度（OD）。

2.3.2 AV/PI檢測細胞凋亡 分別收集PG-BE1貼壁細胞及第3代PG-BE1球細胞，預冷的PBS清洗細胞2次，并重懸于1×Binding Buffer，調整細胞濃度至1×106/mL。取100 μL上述細胞懸液置于流式管中，加5 μL FITC Annexin V及5 μL PI。輕柔震蕩細胞，室溫（25 ℃）避光孵育15 min。每管加400 μL 1×Binding Buffer，流式細胞儀檢測。

2.3.3 免疫熒光檢測細胞ABCG2表達 分別收集PG-BE1貼壁細胞及第3代PG-BE1球細胞，調整細胞濃度至1×105/mL，接種于96孔板。24 h后，每孔依次加入4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X透膜，免疫熒光封閉液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，熒光二抗避光孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，最后加入適量抗熒光淬滅封片液。

2.3.4 Western blot檢測細胞ABCG2、SOX-2、Nanog、OCT-4表達 分別收集PG-BE1貼壁細胞及第3代PG-BE1球細胞，提取蛋白。BCA法測定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉移，5%脫脂奶粉封閉后，一抗（稀釋倍數1∶1000）、二抗（稀釋倍數2∶1000）孵育各1 h，暗室中滴加超敏發光液，凝膠成像系統拍照。

2.4 川芎、蘇木對裸鼠模型抑瘤率的影響

將1×107/mL濃度PG-BE1球細胞接種于裸鼠腋下，0.2 mL/只，24 h后，連續給藥21 d，小鼠脫頸處死，稱量瘤質量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（實驗組平均瘤質量-對照組平均瘤質量）÷對照組平均瘤質量×100%。

2.5 激光共聚焦檢測瘤體內ABCG2蛋白表達

將腫瘤組織從液氮中取出，冷凍切片包埋劑包埋，置于-20 ℃冰凍切片機中待其凝固；將已凝固腫瘤組織進行粗切片，直至露出腫瘤組織為止，切取8 μm厚度、完整的組織切片，平鋪在防脫磨砂載玻片上，室溫放置10 min；然后將玻片浸泡于4 ℃丙酮中，固定10 min；PBS沖洗3次×10 min；再將玻片浸泡于免疫封閉液中，封閉1 h；PBS沖洗3次，滴加一抗Anti-BCRP/ABCG2（按1∶100比例稀釋），4 ℃過夜；PBS沖洗3次，滴加Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）二抗（稀釋濃度1∶200），室溫避光孵育1 h；PBS沖洗，滴加DAPI，室溫避光孵育5 min；PBS沖洗，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.6 Western blot檢測腫瘤組織ABCG2蛋白表達

分別收集各組腫瘤組織，提取蛋白。用BCA法測定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉移，5%脫脂奶粉封閉后，一抗（稀釋倍數1∶1000）、二抗（稀釋倍數2∶1000）孵育各1 h后于暗室中滴加超敏發光液，于ChemiDoc XRS凝膠成像系統拍照，并用Image J軟件分析各組蛋白表達量。

2.7 RT-PCR檢測腫瘤組織ABCG2基因表達

分別提取各組腫瘤組織RNA，應用Nanodrop測定RNA濃度與純度，并驗證RNA完整性。將提取的RNA進行反轉錄及熒光定量，檢測各組基因表達量。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，符合正態分布用t檢驗，不符合正態分布用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 干細胞樣細胞分選結果

接種后第3日可見細胞球形成，隨時間延長，球體積變大，折光率變低，傳代至第3代的PG-BE1球細胞，見圖1。

4.2 CCK-8法檢測結果

PG-BE1球細胞組第3、4、5、6、7日OD值明顯高于PG-BE1貼壁細胞（P<0.01）；以PG-BE1貼壁細胞OD值為基線，其PG-BE1球細胞第3、4、5、6、7日相對OD值分別為0.10、0.17、0.21、0.24、0.32，見圖2。

4.3 AV/PI檢測結果

PG-BE1球細胞和貼壁細胞早期凋亡率分別為0.638%、1.273%（P<0.05）；中晚期凋亡率分別為2.53%、2.78%，PG-BE1球細胞中晚期凋亡率低于PG-BE1貼壁細胞（P>0.05），見圖3。

4.4 免疫熒光檢測結果

PG-BE1球細胞ABCG2高表達，而PG-BE1貼壁細胞ABCG2低表達甚至不表達，二者差異有統計學意義（P<0.05），見圖4、圖5。

4.5 Western blot檢測結果

ABCG2蛋白在PG-BE1球細胞中表達量明顯高于PG-BE1貼壁細胞（P<0.05）。OCT-4、Nanog在PG-BE1貼壁細胞中不表達或低表達，而在PG-BE1球細胞中可見明顯表達（P<0.05）；SOX-2在PG-BE1球細胞及貼壁細胞中表達也有明顯差異（P<0.01）。見圖6。

4.6 不同劑量川芎、蘇木對抑瘤率的影響

川芎高、低劑量組和蘇木高、低劑量組抑瘤率分別為36.26%、42.63%、24.60%、26.32%。與對照組比較，川芎高、低劑量組可明顯抑制瘤體生長（P<0.05），其中川芎低劑量抑瘤率明顯高于川芎高劑量組（P<0.05）；蘇木各劑量組雖對瘤體有一定的抑制作用，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖7。

4.7 激光共聚焦檢測不同劑量川芎、蘇木對瘤組織ABCG2蛋白表達的影響

與對照組比較，蘇木各劑量組ABCG2蛋白表達無明顯差異，川芎各劑量組可明顯抑制ABCG2蛋白的表達，見圖8。

4.8 Western blot檢測不同劑量川芎、蘇木對ABCG2蛋白表達的影響

與對照組比較，川芎低劑量組可抑制ABCG2蛋白的表達（P<0.05），川芎高劑量組對ABCG2蛋白的表達無明顯的抑制作用；蘇木各劑量組對ABCG2蛋白表達均無抑制作用。見圖9。

4.9 RT-PCR檢測不同劑量川芎、蘇木對ABCG2 mRNA表達的影響

與對照組比較，除川芎低劑量組外，各給藥組對ABCG2 mRNA表達均有上調作用，見圖10。

5 討論

側群（side population，SP）細胞可以特異性地將Hoechst33342染料快速泵出細胞外。研究發現，SP細胞具有某些干細胞特性，如具有極強的自我更新及增殖能力[6]。目前，在許多組織胚胎及腫瘤細胞中，都發現了SP細胞的存在[7-11]。他們具有與干細胞相似的干性，如同源性、自我更新能力、多向分化潛能。基于此，很多學者認為SP細胞中富含干細胞，是干細胞研究的重要資源，可以作為干細胞分離、鑒定的一種方法[12]。

而SP細胞之所以可以將Hoechst33342染料泵出細胞外，是因為ABCG2蛋白的存在。三磷酸腺苷結合盒（ATP binding cassette，ABC）超家族是一種由多種轉運體組成的、在機體內廣泛表達的大家族。ABCG2蛋白作為ABC家族成員之一，與SP細胞表型的表達存在密切關系，如ABC轉運蛋白活性可被ABC轉運蛋白抑制劑或者鈣離子通路阻滯劑所抑制，從而減少SP表型[13]。Zhou S等[14]研究發現，雖然不同SP細胞來源于不同的組織，但均表達ABC家族中的ABCG2/BCRP1耐藥基因，經反轉錄基因轉染實驗后發現，ABCG2/BCRP1的表達與SP細胞表型呈強相關，即ABCG2/BCRP1是SP細胞表型特征的決定因素。因此，認為ABCG2蛋白可以作為另一種腫瘤干細胞標志物用于腫瘤干細胞的鑒定。

本實驗應用無血清培養法獲得PG-BE1球細胞，經抗凋亡實驗檢測球細胞凋亡能力、CCK-8法檢測球細胞增殖能力、Western blot檢測干細胞標志物表達發現，該細胞具有較強的增殖能力、抗凋亡能力，高表達ABCG2、Nanog、OCT-4、SOX2等蛋白。而Nanog、OCT4、SOX2基因是干細胞中代表性標志物，與干細胞多潛能性和自我更新能力有密切關系，是目前腫瘤干細胞標志物之一。本實驗中獲得的PG-BE1球細胞在高表達SOX2、OCT-4、Nanog蛋白的同時高表達ABCG2蛋白，表明ABCG2蛋白作為腫瘤干細胞標志物的可靠性。以上體外實驗結果表明，無血清球培養獲得的PG-BE1球細胞具有腫瘤干細胞干性。

目前大量實驗研究顯示，中藥提取物或中醫復方在殺傷腫瘤干細胞方面存在較好療效。研究發現異甘草素可以通過抑制腫瘤干細胞的自我更新及多向分化而明顯降低乳腺癌細胞中SP及CSC的比率[15]。進一步研究發現，GRP78作為異甘草素的直接作用靶點，異甘草素可以剪短ATP表達域中GRP78的表達，進而抑制ATP酶的活性、促進β-catenin降解，導致β-catenin/ABCG2信號通路失活；體內實驗也表明，異甘草素可通過GRP78/β-catenin/ABCG2信號通路增強乳腺癌干細胞的化療敏感性，且對周圍組織及乳腺干細胞無毒副作用。姜黃素通過誘導ABCG2耐藥蛋白的低表達，提高乳腺癌干細胞對絲裂霉素的敏感性，達到殺傷乳腺癌干細胞、減少球細胞形成、低表達腫瘤干細胞標志物CD44+CD24-的目的。經姜黃素干預的乳腺癌細胞對紫杉醇、順鉑、阿霉素等化療藥的敏感性明顯提高[16]。片仔癀對SP細胞分選出的結腸癌干細胞有顯著的殺傷作用，且呈劑量依賴性。其可以抑制結腸癌干細胞活性及成球能力，深入研究發現片仔癀對腫瘤干細胞的殺傷作用與其可以抑制ABCG2 mRNA的表達有關[17]。

本研究以ABCG2蛋白作為腫瘤干細胞標志物，觀察蘇木、川芎體內實驗對PG-BE1干細胞樣細胞的作用，經激光共聚焦及Western blot檢測發現，低、高劑量蘇木及高劑量川芎對ABCG2蛋白并無抑制作用，而低劑量川芎可明顯抑制ABCG2蛋白的表達。故而認為低劑量川芎對PG-BE1干細胞樣細胞的生長有抑制作用。進一步經RT-PCR檢測后發現，低劑量川芎組可明顯抑制ABCG2 mRNA的表達，其余各組對ABCG2 mRNA表達均為上調作用，Western blot與RT-PCR的結果基本一致。因此，考慮低劑量川芎對ABCG2蛋白的抑制作用可能與其抑制ABCG2 mRNA的表達相關，低劑量川芎對PG-BE1干細胞樣細胞殺傷作用可能是通過抑制ABCG2蛋白在mRNA水平的表達實現的，其具體機制尚需進一步研究。

參考文獻：

[1] GERBER B. Recurrent breast cancer：treatment strategies for maintaining and prolonging good quality of life[J]. Dtsch Arztebl Int，2010，107（6）：85-91.

[2] 楊棟，張培彤，王耀焓，等.川芎嗪對高轉移性人肺巨細胞癌PG-BE1干細胞樣細胞黏附能力的影響[J].中醫雜志，2015，56（13）：1140-1144.

[3] 江保中，張培彤，楊棟，等.蘇木對PG細胞增殖、黏附及侵襲能力的影響[J].中國腫瘤，2014，23（3）：239-243.

[4] 郭秀偉，張培彤，楊棟，等.蘇木含藥血清對人肺癌PG細胞增殖周期影響的對比研究[J].中國中西醫結合雜志，2014，34（6）：745-750.

[5] 郭秀偉，張培彤，楊棟，等.雞血藤血清聯合順鉑對人肺癌PG細胞增殖及周期影響的研究[J].中國腫瘤，2016，26（3）：219-225.

[6] YEH J Y， HUANG W J， KAN S F， et al. Effects of bufalin and cinobufagin on the proliferation of androgen dependent and independent prostate cancer cells[J]. Prostate，2003，54（2）：112- 124.

[7] NIGAM A. Breast cancer stem cells， pathways and therapeytic perspect perspectives 2011[J]. Indian J Surg，2013，75（3）：170-180.

[8] GAO Y J， LI B， WU X Y， et al. Thyroid tumor-initiating cells：increasing evidence and opportunities for anticancer therapy （review）[J]. Oncol Rep，2014，31（3）：1035-1042.

[9] ZHANG H H， CAI A Z， WEI X M， et al. Characterization of cancer stem-like cells in the side population cells of human gastric cancer cell line MKN-45[J]. J Zhejiang Univ-Sci B，2013，14（3）：216-223.

[10] LIU J， CHI N， ZHANG J Y， et al. Isolation and characterization of cancer stem cells from medulloblastoma[J]. Genet Mol Res，2015， 14（2）：3355-3361.

[11] XIE Z Y， LV K， XIONG Y， et al. ABCG2-meditated multidrug resistance and tumor-initiating capacity of side population cells from colon cancer[J]. Oncol Res Treat，2014，37（11）：666-668.

[12] CHALLEN G A， LITTLE M H. A side order of stem cells：the SP phenotype[J]. Stem Cells，2006，24（1）：3-12.

[13] UNNO K， JAIN M， LIAO R. Cardiac side population cells：moving toward the center stage in cardiac regeneration[J]. Circ Res， 2012，110（10）：1355-1363.

[14] ZHOU S， SCHUETZ J D， BUNTING K D， et al. The ABC transporter BCRP1/ABCG2 is expressed in awide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype[J]. Nat Med，2001，7（9）：1028-1034.

[15] WANG N， WANG Z H， CHENG P， et al. Dietary compound isoliquiritigenin targets GRP78 to chemosensitize breast cancer stem cells via β-catenin/ABCG2 signaling[J]. Carcinogenesis， 2014，35（11）：2544-2554.

[16] ZHOU Q M， YE M N， LU Y Y， et al. Curcumin improves the tumoricidal effect of mitomycin C by suppressing ABCG2 expression in stem cell-like breast cancer cells[J]. PLoS One，2015，10（8）：e0136694.

[17] WEI L H， CHEN P Y， CHEN Y Q， et al. Pien Tze Huang suppresses the stem-like side population in colorectal cancer cells[J]. Molecular Medicine Reports，2014，9（1）：261-266.

（收稿日期：2016-11-06）

（修回日期：2017-02-26；編輯：華強）