刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細胞Wnt/βcatenin信號通路的影響

依香叫　李金誠　王松月　燕夢云　崔箭　裴凌鵬

[摘要]該文研究了不同濃度刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細胞Wnt/βcatenin信號通路中βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin表達的影響。經SPF級健康雌性SD大鼠（80只）給予蒸餾水、刺老苞根皮水煎劑高、中、低3種劑量，連續灌胃7 d，制備刺老苞根皮含藥血清。體外培養原代成骨細胞（OB）并鑒定，取第3代成骨細胞，培養48 h后用各組含藥血清干預培養10 d，采用茜素紅染色鈣化結節并計數；干預培養48 h后收集細胞，分別采用Realtime PCR（RTPCR）和Western blot 法測定βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin的表達情況。結果顯示，經鑒定體外培養細胞為原代成骨細胞；在干預培養后，與模型組相比，各劑量組可促進原代成骨細胞的礦化能力，且上調βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF mRNA和蛋白的表達，下調Axin mRNA和蛋白的表達。結果發現刺老苞根皮含藥血清可通過調節原代成骨細胞Wnt/βcatenin信號通路中βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin表達，增強成骨細胞的分化和增殖。

[關鍵詞]刺老苞根皮； 原代成骨細胞； Wnt/βcatenin； 信號通路

[Abstract]This paper was aimed to investigate the effect of Aralia echinocaulis containing serum on expression of βcatenin， Wnt1， Frizzed2， TCF and Axin in Wnt/βcatenin signaling pathway of primary osteoblasts SD healthy female rats （n=80） were used to make A echinocaulis containing serum by gastric perfusion for seven days with distilled water， A echinocaulis decoction high dosage， middle dosage， and low dosage In vitro， primary osteoblasts were cultured and identified The third generation primary osteoblasts were taken and cultured for 48 h， then cells were treated with the different drug serums for 10 days and calcified nodules were counted by alizarin red staining The cells were collected after treatment for 48 h and the expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， TCF and Axin were detected by Realtime PCR and Western blot The results suggested that the in vitro cells were primary osteoblasts； and after treatment， various doses groups could promote the mineralization ability of primary osteoblasts， upregulate the mRNA and protein expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， and TCF， and downregulate the mRNA and protein expression levels of Axin These findings indicated that A echinocaulis containing serum can enhance the differentiation and proliferation of osteoblasts by regulating the expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， TCF and Axin in Wnt/βcatenin signaling pathway of primary osteoblasts

[Key words]Aralia echinocaulis； primary osteoblasts； Wnt/βcatenin； signaling pathway

近年來，民族藥物資源的開發和利用倍受國內外研究學者的關注和青睞，傳統土家族醫藥——刺老苞根皮為五加科植物楤木Aralia chinensis L或棘莖楤木A echinocaulis HandMazz 的根皮或莖皮，分布于我國西南、華南及華東山區，包括云南東南部及西雙版納地區、貴州黔南州及黔東南州、廣西壯族自治區、海南省五指山周圍地區、廣東省山區、福建省中南部地區、江西省南端、臺灣省等地山區，資源非常豐富[12]。該藥材片狀或槽狀，氣微香，嚼之帶黏液性，味辛，性平。歸肝、腎經，功能滋陰健腎，祛風濕，壯筋骨，散瘀血，消腫毒。可用于風濕痹痛、跌打損傷、骨折等治療[34]。骨折愈合是一個復雜的全身性協調活動過程。在骨折愈合過程中，主要由負責骨吸收的破骨細胞和負責骨形成的成骨細胞共同完成，骨折后，成骨細胞對此信號做出應答，募集破骨細胞到骨折部位，促進骨質吸收，緊接著成骨細胞進行重新成骨，在神經調節和生物力學作用下使損傷骨組織恢復正常。在整個骨折愈合過程中，成骨細胞扮演者重要的角色，經研究表明，在經典Wnt信號轉導通路作用下可引導成骨細胞分化，促進骨折愈合。目前實驗證明刺老苞根皮具有促進大鼠骨折愈合的作用，但其分子機制層面研究甚少，為了進一步明確刺老苞根皮含藥血清對成骨細胞分化、增殖和功能的影響，本實驗通過觀察刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細胞Wnt/βcatenin信號通路中相關基因和蛋白βcatenin，Wnt1，Frizzled2，TCF，Axin表達的作用，探討刺老苞根皮修復大鼠骨折的分子作用機制。

1材料

11動物新生24 h SD大鼠乳鼠10只。SPF級健康雌性SD大鼠80只，3月齡，體重（270±20） g，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（軍）20120004。

12藥物刺老苞根皮，采于湖北恩施地區，經北京中醫藥大學生藥系楊瑤珺教授鑒定，批號0P1101，湖北恩施中藥材有限公司。

13試劑αMEM培養基，胎牛血清，025%胰蛋白酶溶液（Gibco，美國），青霉素/鏈霉素，DMSO，II型膠原酶，β甘油磷酸鈉，抗壞血酸，茜素紅，二甲基亞砜（Sigma，美國），PBS 磷酸鹽緩沖液（粉劑）（北京昌盛生物技術有限責任公司），堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物制品有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（北京賽諾博生物科技有限公司），ECL（Millipore，美國），山羊抗兔IgG（H+L），HRP，山羊抗小鼠IgG（H+L），HRP，牛抗山羊IgG（H+L），HRP（北京天德悅生物科技有限責任公司），GAPDH 鼠單抗（Immunoway，美國），βcatenin，Wnt1，TCF（Cell Signaling Technology，美國），Axin，Frizzled2（Santa Cruz，美國），TRNzol Universal 總RNA 提取試劑，FastQuant RT Kit（With gDNase）（天根生化科技有限公司）。

14儀器細胞超凈操作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司），CO2培養箱，Fresco低溫冷凍離心機，MultiSkan3酶標儀（Thermo Scientific，美國），電腦型倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本），Mini P4電泳槽，濕轉電泳槽（北京凱元信瑞儀器有限公司），電泳儀，半干槽（BioRad，美國），水平脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器有限公司），酸度計pH211（Hanna，意大利），電動組織勻漿器（Fluka，美國），ABI 7900HT熒光定量PCR儀（KAPA Biosystems，美國）。

2方法

21刺老苞根皮含藥血清制備與分組含藥血清制備：SPF級健康雌性SD大鼠80只適應性喂養1周后，通過在脛骨上打孔模擬骨折二期愈合的理想力學環境：早期模擬堅強固定下的力學環境，后期隨骨傳導支架形成，開始承受應力刺激，模擬二期愈合力學環境。術后第2天用SPSS軟件隨機數字的方法分成4組，分別為模型組、刺老苞根皮低劑量組、刺老苞根皮中劑量組、刺老苞根皮高劑量組，每組20只。用藥劑量根據人體習用安全劑量（70 kg體重20 g生藥），按人/鼠表面積比率換算等效計量法計算。刺老苞根皮灌胃劑量為18 g·kg-1·d-1，以臨床劑量為中劑量，1/2，2倍劑量為低、高劑量（即分別為09，36 g·kg-1·d-1）。模型組給予等劑量等頻率蒸餾水。術后7 d取材（取材前進食12 h），末次給藥后1 h，稱重，3%戊巴比妥鈉（3 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，在無菌操作下腹主動脈采血，將采集來的血樣在室溫下靜置2 h后，1 800 r·min-1離心20 min，分離出血清，56 ℃水浴滅活30 min，在022 μm微孔膜過濾除菌后分裝，保存于-20 ℃備用。

實驗共分為4組：模型組（20%模型組大鼠血清+αMEM）、低劑量組（20%刺老苞低劑量含藥血清+αMEM）、中劑量組（20%刺老苞中劑量含藥血清+αMEM）、高劑量組（20%刺老苞高劑量含藥血清+αMEM）。

22原代成骨細胞培養及鑒定取新生24 h內的SD乳鼠10只，放入75%乙醇浸洗乳鼠，將乳鼠轉移到一個有蓋培養皿內，在無菌操作下，分離顱骨，清除顱骨表面的結締組織，用PBS簡單沖洗顱蓋骨后放入15 mL離心管內，加入3 mL 025%胰蛋白酶液Ⅱ型膠原酶溶液（1∶2），37 ℃恒溫水浴振蕩消化5 min，棄上清液。加入3 mL消化液，37 ℃恒溫水浴振蕩消化10 min，收集上清液，并重復消化4次，將收集的消化液1 500 r·min-1離心4 min，棄上清液，重懸細胞，調整細胞密度后接種于25 cm2培養瓶，培養24 h后，換成骨細胞分化培養基（10% FBS+10 mmol·L-1β甘油磷酸鈉+50 mg·L-1抗壞血酸），每3 d換液1次，待細胞融合50%～70%后，消化并傳代，取3～6代細胞進行試驗。取第3代純化的原代成骨細胞，經ALP染色和茜素紅染色鑒定獲得的是成骨細胞。

23茜素紅染色法檢測骨礦化功能收集第3代原代成骨細胞，以1×105 個/mL，接種于24孔板，每孔1 mL，培養48 h后按實驗分組更換不同培養基，每組設3個復孔，每2 d換液1次，并每天觀察細胞狀態，10 d后，取出24孔板，用PBS沖洗3遍，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水沖洗3遍，每孔加入2 mL茜素紅染液，放置于37 ℃，45 min后蒸餾水沖洗3遍，用熒光倒置顯微鏡拍照，并計數鈣化結節數量。

24Westernblot檢測βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin的蛋白表達量收集第3代原代成骨細胞，以1×105個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，培養48 h后按實驗分組更換不同培養基，每組設3個復孔，培養48 h后收集細胞，用預冷RIPA蛋白抽提試劑提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，調整蛋白濃度后煮沸變性進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，將膜完全浸沒于3%BSATBST中室溫輕搖30 min，室溫下一抗孵育10 min，4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗孵育40 min，TBST洗膜，ECL加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光，顯影，定影，對印跡目的條帶進行掃描，TotalLab Quant軟件分析圖片中的條帶灰度值。實驗重復4次。

25熒光定量PCR檢測βcatenin，Wnt1，Frizzed2，TCF和Axin mRNA的表達量收集第3代原代成骨細胞，以1×105 個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，培養48 h后按實驗分組更換不同培養基，每組設3個復孔，培養48 h后收集細胞，用Trizol Universal 試劑提取總RNA，使用FastQuant RT Kit（With gDNase）將RNA逆轉錄合成cDNA。使用PrimerBlast設計引物，退火溫度55～60 ℃，PCR擴增反應體系：95 ℃預變性30 s進入循環，95 ℃變性15 s，56 ℃復性20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。擴增之后，做溶解曲線檢測產物的均一性。每個反應均重復3次。引物序列見表1。經檢測，每對引物的擴增效率均接近于1。使用2-ΔΔCt方法計算樣本目標基因相對含量，GAPDH為內參基因。

經瓊脂糖凝膠電泳，分析數據。

26統計學分析實驗數據使用SPSS 200軟件進行數據分析處理。以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<005為有統計學意義，P<001有顯著統計學意義。

3結果

31原代成骨細胞的鑒定原代成骨細胞用成骨細胞完全培養基（含10%胎牛血清）在37 ℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。經倒置顯微鏡觀察，細胞在24 h后開始貼壁，48 h后完全貼壁，細胞為單核，呈長梭形和多角形等形態，10 d左右細胞融合成鋪路石樣，并伴有礦化結節的出現，見圖1。

32茜素紅染色法檢測骨礦化功能不同濃度含藥血清對成骨細胞作用10 d后，經茜素紅染色后，計數鈣化結節的個數，結果顯示：與對照組相比較，不同濃度含藥血清組干預后的成骨細胞產生的鈣化結節皆有所增多，低劑量組差異明顯（P<005），中劑量組和高劑量組差異顯著（P<001），見表2。

33Western blot檢測βcatenin，Wnt1，Frizzled2，TCF和Axin的蛋白表達量經Western blot檢測不同濃度含藥血清對原代成骨細胞分化過程中不同細胞因子相對蛋白表達量的影響，結果顯示：與對照組相比較，不同濃度含藥血清組可以有效地上調βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2蛋白表達，下調Axin蛋白表達。其中與對照組相比，低劑量組的βcatenin，TCF和Frizzled2蛋白表達明顯上調（P<005），中劑量組βcatenin蛋白表達顯著上調（P<001），TCF和Frizzled2蛋白表達明顯上調（P<005），高劑量組βcatenin，TCF和Frizzled2蛋白表達顯著上調（P<001）；各劑量組Wnt1蛋白的表達量較對照組顯著上調（P<001）。與對照組相比，低劑量組Axin蛋白表達下調（P<005），且中劑量組與高劑量組較對照組顯著下調（P<001），見表3。

34熒光定量PCR 檢測βcatenin，Wnt1，Frizzled2，TCF，Axin mRNA的表達量經熒光實時定量PCR（Realtime PCR）檢測含藥血清對原代成骨細胞特定表達基因的相對表達量。結果顯示：與對照組相比較，不同濃度含藥血清組可以有效地上調βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2 mRNA表達，下調Axin mRNA表達。其中與對照組相比，低劑量組的βcatenin，TCF，Wnt1和Frizzled2 mRNA表達較對照組明顯上調（P<005），中劑量組中βcatenin，Wnt1 mRNA表達量顯著上調（P<001），TCF，Frizzled2 mRNA表達明顯上調（P<005）；高劑量組中βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2 mRNA表達顯著上調（P<001）。與對照組相比，低劑量組和中劑量組中 Axin mRNA表達下調（P<005），高劑量組Axin mRNA表達顯著下調（P<001），見表4。

4討論

Wnt/βcatenin信號通路被稱為Wnt的經典通路，是4條Wnt信號通路之一[3]。Wnt經典通路，通過βcatenin激活基因轉錄，是骨重建調控的重要途徑。在骨重建過程中成骨細胞起著關鍵性的作用，因此探討成骨細胞的成骨分化對研究骨折愈合有著重要的意義。大量研究證明，在Wnt的經典通路中βcatenin是核心調控因子，它決定著骨軟骨祖細胞在模內和軟骨內向軟骨細胞還是成骨細胞分化的重要因素，當Wnt與卷曲蛋白（Frizzled2）受體結合后，通過破壞由Axin，APC，GSK3，βcatenin等結合形成的“破壞復合體”，使細胞質內的βcatenin穩定，并很快進入細胞核內與轉錄因子TCF/LEF結合，促進TCF/LEF與特定靶基因的啟動子結合，激活靶基因轉錄，使骨髓間充質干細胞向骨軟骨細胞前體分化，從而促使成骨細胞的成骨分化，最終促進骨形成，使骨折愈合[7]。由此可見βcatenin，TCF，Wnt1，Frizzled2在Wnt/βcatenin信號通路起正調節作用，Axin具有負向調節作用。土家族在長期醫療實踐中，形成了土家族傳統醫學理論體系，其中的“三元”學說認為，骨折后必須經脈暢通，氣、血、精充分滋養，三元（頭元、腹元、足元）調和，冷熱平衡，才能愈合。刺老苞根皮是土家族習用草藥，有著滋陰補腎，祛風濕，壯筋骨，散淤血，消腫毒等功效。在治療骨折時，慣用內服刺老苞根皮水煎劑，并有很好的療效[56，89]。以往研究表明，刺老苞根皮黃酮化合物可有效抗維甲酸引起的大鼠骨生長抑制及骨丟失，并對絕經后所致骨質疏松引起的骨折有一定防治作用[10]。刺老苞根皮水提物有增強堿性磷酸酶活性，促進骨形成，提高骨礦物質水平與骨密度值的作用[11]。在臨床上，通過刺老苞膠囊治療60例膝關節骨性關節炎患者的臨床療效發現刺老苞膠囊既能減輕膝關節骨性關節炎患者局部癥狀、體征，恢復關節功能，并能改善患者其他并發癥，且服用安全[12]。現實驗結果表明：經刺老苞根皮含藥血清干預后，Axin表達下調，βcatenin，TCF，Wnt1和Frizzled2表達上調，說明由Axin，APC，GSK3，βcatenin等結合形成的“破壞復合體”被破壞，胞質內βcatenin積累并轉移至細胞核內，與TCF/LEF啟動靶基因，從而促進成骨細胞的分化與增殖。由于βcatenin是Runx2和Osterix的上游信號因子，目前研究證明Runx2和Osterix缺失的小鼠，完全缺乏成骨細胞，產生的軟骨骨架完全缺乏礦化基質[1315]。因此，實驗選取βcatenin，Wnt1，TCF，Axin 和 Frizzled2細胞因子探討刺老苞根皮對骨折愈合作用的分子機制，為進一步研究提供新思路，為臨床用藥提供新依據。盡管如此，有關刺老苞根皮促進骨折愈合的作用機制還存在很多不清楚的地方，尚需進一步探討。

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[責任編輯張寧寧]