基于道南效應(yīng)和溶解擴散效應(yīng)分析低濃度乙醇中綠原酸的納濾分離規(guī)律

李存玉　劉莉成　金立陽　李紅陽　彭國平

[摘要]該文采用納濾分離低濃度乙醇中綠原酸，探索道南效應(yīng)和溶解擴散效應(yīng)對綠原酸分離的影響規(guī)律。實驗表明溶液pH、乙醇濃度影響綠原酸分離行為，30%乙醇中綠原酸pH 3～7，截留率相差7027%，通過響應(yīng)面法建立二次回歸模型，納濾膜截留相對分子質(zhì)量、溶液pH、乙醇濃度存在交互作用，綠原酸存在狀態(tài)決定了其分離行為，隨著乙醇濃度的增加，游離態(tài)綠原酸因溶解擴散效應(yīng)易吸附溶解在膜表面而促進其透過，解離態(tài)綠原酸在道南效應(yīng)和溶解擴散效應(yīng)的雙重作用下，難以進入膜表面，而截留率顯著升高。優(yōu)選出的納濾富集工藝相較于傳統(tǒng)減壓濃縮優(yōu)勢明顯，解決了中藥分離精制過程中，低濃度有機試劑環(huán)境中中藥成分在溶劑回收時存在效率低下、成分損失嚴重的技術(shù)難題。

[關(guān)鍵詞]綠原酸； 納濾； 乙醇，道南效應(yīng)； 溶解擴散效應(yīng)

[Abstract]To separate chlorogenic acid from low concentration ethanol and explore the influence of Donnan effect and solutiondiffusion effect on the nanofiltration separation rule The experiment showed that solution pH and ethanol volume percent had influences on the separation of chlorogenic acid Within the pH values from 3 to 7 for chlorogenic acid in 30% ethanol， the rejection rate of chlorogenic acid was changed by 7027% Through the response surface method for quadratic regression model， an interaction had been found in molecule weight cutoff， pH and ethanol volume percent In fixed nanofiltration apparatus， the existence states of chlorogenic acid determinedits separation rules With the increase of ethanol concentration， the free form chlorogenic acid was easily adsorbed， dissolved on membrane surface and then caused high transmittance due to the solutiondiffusion effect However， at the same time， due to the double effects of Donnan effect and solutiondiffusion effect， the ionic state of chlorogenic acid was hard to be adsorbed in membrane surface and thus caused high rejection rate The combination of BoxBehnken design and response surface analysis can well optimize the concentrate process by nanofiltration， and the results showed that nanofiltration had several big advantages over the traditional vacuum concentrate technology， meanwhile， and solved the problems of low efficiency and serious component lossesin the Chinese medicines separation process for low concentration organic solventwater solution

[Key words]chlorogenic acid； nanofiltration； ethanol； Donnan effect； solutiondiffusion effect

中藥分離精制過程中，含有低濃度有機試劑的中間體在溶劑回收時存在效率低下、成分損失嚴重的技術(shù)難題。如柱色譜分離時采用不同濃度有機溶劑洗脫，洗脫液中有機溶劑濃度偏低時需要高溫回收溶劑，對富含酚酸等熱敏性成分具有破壞，且難以控制成分轉(zhuǎn)化而影響分離效率，目前尚未出現(xiàn)適用可行的技術(shù)手段 [1]。納濾是膜分離技術(shù)中的一種，截留相對分子質(zhì)量在100～1 000，具有分離過程可常溫操作，無熱效應(yīng)，能耗低等技術(shù)優(yōu)勢[2]，在熱敏性中藥成分分離精制領(lǐng)域具有獨特優(yōu)勢[3]。納濾對溶質(zhì)分子的分離原理主要包含道南效應(yīng)和溶解擴散效應(yīng)，其中道南效應(yīng)又稱電荷效應(yīng)，納濾膜荷負電性，與離子間形成靜電作用，加上立體阻礙，造成膜對離子的截留率有差異；在含不同價態(tài)離子的多元體系中，道南效應(yīng)使得膜對不同離子的選擇性不一樣。此外，由于納濾膜孔與溶質(zhì)分子的相互作用，也呈現(xiàn)出在位阻效應(yīng)基礎(chǔ)上的溶解擴散理論，溶質(zhì)溶解在膜中，并隨著推動力擴散傳遞，物相之間存在化學(xué)平衡。但目前對低濃度有機溶劑處理尚處于初步階段[4]，且分離機制不清晰。本文以富含酚酸的金銀花為例，探索低濃度乙醇環(huán)境中的綠原酸分離規(guī)律。

金銀花為忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或帶初開的花，因具有清熱解毒、疏散風熱等功效[5]而廣泛用于臨床，如清開靈注射液、銀黃注射液等。金銀花中主要成分是以綠原酸為代表的酚酸，熱穩(wěn)定性差，長時間加熱易分解[6]，本文結(jié)合納濾分離的技術(shù)優(yōu)勢，在單因素考察的基礎(chǔ)上，以納濾截留相對分子質(zhì)量、乙醇濃度及pH為影響因子，應(yīng)用BoxBehnken中心組合設(shè)計建立數(shù)學(xué)模型[7]，以綠原酸截留率作為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析軟件分析，優(yōu)選納濾濃縮工藝參數(shù)，同時與常規(guī)濃縮工藝對比，分析納濾濃縮的可行性，從而為低濃度有機水溶液中藥物成分精制純化提供技術(shù)支撐。

1材料

金銀花藥材購自安徽惠隆中藥飲片有限公司，批號20150702，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為忍冬科植物忍冬L japonica的干燥花蕾。

復(fù)合聚酰胺納濾膜，截留相對分子質(zhì)量100，450，800（南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；綠原酸對照品（批號110753200413，質(zhì)量分數(shù)≥98%），購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD檢測器（美國安捷倫公司）；TNZ1納濾分離設(shè)備（南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；RE2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）；SHBⅢ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；PB10型pH計（德國Sartorius公司）；KH250B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

2方法

21金銀花供試品溶液

稱取金銀花藥材適量，分別加入10，8倍純化水提取，每次1 h，045 μm微孔濾膜過濾，合并濾液，液相檢測綠原酸濃度，進而按照試驗設(shè)計加入乙醇試劑，在保持綠原酸濃度不變的前提下，調(diào)節(jié)金銀花提取液中乙醇濃度達到試驗需求。

22納濾操作

組裝納濾膜與TNZ1納濾分離設(shè)備，取金銀花供試品溶液置于納濾系統(tǒng)中進行循環(huán)平衡，待綠原酸在納濾膜中的吸附解吸附達到平衡時，取樣平衡液，進而將溶液進行納濾，待納濾完成后，取樣納濾液。

23pH對綠原酸截留率的影響

在相同綠原酸濃度條件下，選擇金銀花10%乙醇為供試品溶液，調(diào)節(jié)pH為2，3，4，5，6，7，8，采用截留相對分子質(zhì)量450的納濾膜進行富集濃縮，待納濾完成后，根據(jù)平衡液及納濾液中綠原酸濃度，分析pH對綠原酸截留率的影響。

24乙醇濃度對綠原酸截留率的影響

在相同綠原酸濃度條件下，pH為3，5，7，調(diào)節(jié)乙醇濃度分別為0，5%，10%，20%，30%的金銀花供試品溶液，采用截留相對分子質(zhì)量450的納濾膜進行富集濃縮，待納濾完成后，根據(jù)平衡液及納濾液中綠原酸濃度，分析乙醇濃度對綠原酸截留率的影響。

25響應(yīng)曲面試驗設(shè)計分析因素交互作用

對含有有機試劑的金銀花提取物溶液進行納濾富集，其中乙醇濃度和溶液pH對綠原酸截留率具有一定影響，且二者存在交互作用，基于此采用DesignExpert 806軟件，根據(jù)中藥提取液在膜分離精制過程中的關(guān)鍵影響因素：納濾膜截留相對分子質(zhì)量、乙醇濃度、溶液pH作為變量，以-1，0，1代表變量水平，進行BoxBehnken設(shè)計三因素三水平實驗方案，見表1。

26減壓濃縮對比

根據(jù)響應(yīng)面實驗優(yōu)選出的對乙醇濃度參數(shù)，配置金銀花提取物溶液進行減壓濃縮，操作壓力-010 MPa，溫度80 ℃，取金銀花提取物溶液1 000 mL濃縮至100 mL，分析減壓濃縮對綠原酸轉(zhuǎn)移率的影響。

27綠原酸檢測

按照2015年版《中國藥典》一部，金銀花含量測定項下方法測定。

271色譜條件Hanbon Hedera ODS2色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈04%磷酸溶液（13∶87），檢測波長327 nm，流速1 mL·min-1，理論塔板數(shù)按綠原酸計算應(yīng)不低于1 000。

272對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品0020 1 g，置10 mL量瓶中，用流動相溶解并制成每1 mL含綠原酸201 mg的溶液。

273線性關(guān)系精密吸取綠原酸對照品溶液 005，010，020，050，100，200 mL 分別置于20 mL的量瓶中，流動相定容至刻度，Agilent 1100高效液相色譜儀檢測，以峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液濃度為橫坐標（X），得線性回歸方程Y=1032X-1101，R2=0999 4。綠原酸在5025～201 mg·L-1，線性關(guān)系良好。

274樣品測定取待測樣品按271項下的色譜條件，進樣量10 μL，高效液相色譜儀測定峰面積，將測得的峰面積積分值代入273項回歸方程計算待測樣品中綠原酸含量。

28截留率和轉(zhuǎn)移率計算

分別精密吸取納濾（或減壓濃縮）分離過程中產(chǎn)生的原液、平衡液、納濾（或濃縮）液，按上述相關(guān)項下的檢測條件，計算待測組分的質(zhì)量濃度。

R=（1-C1C2）×100%（1）

D=C3·VC0·V0×100%（2）

式中，R為截留率，D為轉(zhuǎn)移率，C0為原液中綠原酸濃度，C1為納濾液中綠原酸濃度，C2為平衡液中綠原酸濃度，C3為減壓濃縮液中綠原酸濃度，V0為原液體積，V為減壓濃縮液體積。

3結(jié)果

31pH對綠原酸納濾分離的影響

綠原酸截留率曲線見圖1，在10%乙醇環(huán)境中，隨著溶液pH升高其截留率呈現(xiàn)出隨之增加的趨勢，其中在pH 3～7升高趨勢明顯，因此在響應(yīng)曲面法參數(shù)優(yōu)選中著重進行考察。綠原酸截留率的變化是由于其存在狀態(tài)從游離態(tài)逐步向離子態(tài)轉(zhuǎn)變，根據(jù)納濾膜分離的道南效應(yīng)[89]，從而引起截留率升高。而在pH 2～4綠原酸截留率偏低，是由于游離態(tài)存在的綠原酸在含有有機溶劑的溶液環(huán)境中的納濾溶解擴散系數(shù)增加[1011]，促進綠原酸通過納濾膜，引起截留率下降，從而提示pH與有機試劑在納濾分離時存在交互作用。

32乙醇濃度對綠原酸納濾分離的影響

不同pH條件下綠原酸截留率曲線見圖2，乙醇濃度對綠原酸截留率的影響不盡相同。當pH 3時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率呈現(xiàn)出下降趨勢；當pH升高至5以上時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率呈現(xiàn)則明顯升高。說明綠原酸存在狀態(tài)決定了其納濾分離行為，當以游離態(tài)形式存在時，乙醇濃度增加提升了其膜面溶解擴散系數(shù)[12]，而隨著游離態(tài)向解離態(tài)的轉(zhuǎn)化，增強了綠原酸與膜面的道南效應(yīng)，導(dǎo)致解離態(tài)綠原酸難以進入納濾膜表面，且此效應(yīng)與乙醇濃度呈現(xiàn)出一定正相關(guān)。當pH為7時，綠原酸在水溶液條件下的截留率接近90%，雖然具有較高的截留率，但為保證綠原酸穩(wěn)定性，操作條件傾向于酸性溶液環(huán)境。基于膜截留相對分子質(zhì)量、溶液pH、乙醇濃度對綠原酸截留行為的交互影響，選擇響應(yīng)面法對綠原酸的分離行為及濃縮參數(shù)進行優(yōu)化研究。

33響應(yīng)面法分析優(yōu)化納濾分離參數(shù)

根據(jù)BoxBenhnken中心組合設(shè)計原理，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，根據(jù)前期的實驗結(jié)果，在排除溶質(zhì)與膜面吸附的前提下，操作方法為：溶液溫度20 ℃、操作壓力10 MPa條件下，每組試驗平行操作3次，截留率取平均值。選取截留相對分子質(zhì)量、乙醇濃度、pH 3個因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，研究三因素不同組合對綠原酸截留率的影響。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

331模型方程建立與顯著性檢驗利用DesignExpert 806軟件對試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到綠原酸截留率對截留相對分子質(zhì)量、乙醇濃度、pH 3個因素的二次多項回歸模型：綠原酸截留率Y=8346-1164 A+597B+2154C+350AB+1181AC-290 BC-071 A2+025 B2+10944 C2。回歸F為11259，在所考察的試驗范圍內(nèi)，3個因素對綠原酸截留率影響的排序為C>A>B。多元相關(guān)系數(shù)R2=0993 1，預(yù)測R2=0937 4，調(diào)整R2=0984 3，說明模型對試驗實際情況擬合較好；P<0000 1說明該模型高度顯著，可用來進行響應(yīng)值的預(yù)測，試驗設(shè)計方案正確。

332響應(yīng)曲面分析及條件優(yōu)化多元回歸方程式所做的響應(yīng)曲面圖，見圖3。由此可對兩因素交互影響綠原酸截留率進行分析與評價，以確定最佳因素水平范圍。可以看出，所考察因素對綠原酸截留率均有不同程度的影響，其中溶液pH影響顯著，隨著溶液環(huán)境由酸到堿，綠原酸逐步離子化成鹽，根據(jù)納濾膜分離的電荷效應(yīng)，以離子形式存在的綠原酸與荷負電的納濾膜之間的道南效應(yīng)要強于游離態(tài)，從而引起成分截留率升高。納濾膜的截留相對分子質(zhì)量的影響顯著，隨著截留相對分子質(zhì)量減小，綠原酸截留率隨之增大；乙醇濃度對綠原酸截留率影響顯著，曲面斜率大，隨著乙醇濃度的升高，以游離態(tài)形式存在的綠原酸成分擴散系數(shù)增加，從而出現(xiàn)截留率下降的現(xiàn)象，而以解離態(tài)存在的綠原酸根據(jù)溶解擴散模型，由于在膜面的溶解度較低，截留率上升。

綠原酸截留率數(shù)據(jù)中A，B，C 3因素之間存在一定的交互作用，納濾膜截留相對分子質(zhì)量和pH對綠原酸截留率影響交互作用顯著，隨著pH的升高或截留相對分子質(zhì)量的降低，綠原酸截留率呈現(xiàn)上升趨勢；同理，納濾膜截留相對分子質(zhì)量和乙醇濃度對綠原酸截留率影響交互作用較顯著，在pH 5條件下，隨著乙醇濃度升高或截留相對分子質(zhì)量降低，綠原酸截留率呈現(xiàn)上升趨勢；溶液pH與乙醇濃度也表現(xiàn)出一定的交互作用，這主要是綠原酸存在狀態(tài)所引起的，在pH 3時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率下降，而pH 7時，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸截留率則明顯升高。

34納濾富集參數(shù)優(yōu)化及減壓濃縮對比分析

由DesignExpert軟件優(yōu)化分析，以提高綠原酸截留率和膜分離效率、保障綠原酸等酚酸類成分的穩(wěn)定性[13]為目的，得到綠原酸的最佳納濾富集工藝為：截留相對分子質(zhì)量450，乙醇濃度1637%，pH 613，理論計算綠原酸截留率為9500%。為了驗證回歸模型的有效性，根據(jù)擬合的最佳工藝參數(shù)和試劑操作的可行性，調(diào)整乙醇濃度1600%、pH 60，截留相對分子質(zhì)量450條件下進行驗證性實驗并與減壓濃縮工藝進行對比，結(jié)果見表4。在綠原酸保留方面，納濾高于傳統(tǒng)的減壓濃縮，且由于乙醇含量較低，減壓濃縮效率低下。在對比試驗開展過程中發(fā)現(xiàn)納濾富集周期不足減壓濃縮的10%，富集效率及技術(shù)優(yōu)勢明顯。

4討論

中藥分離精制過程中，含有低濃度有機試劑的中間體在溶劑回收時存在效率低下、成分損失嚴重的技術(shù)難題。納濾分離主要用于水溶液環(huán)境的富集純化，對于低濃度有機試劑的回收尚處于空白應(yīng)用階段，以低濃度乙醇中綠原酸的富集為例發(fā)現(xiàn)，綠原酸存在狀態(tài)決定了其分離行為，說明對于低濃度有機溶劑的納濾分離主要遵循道南效應(yīng)和溶解擴散理論[14]。酸性條件下的綠原酸主要以游離態(tài)形式存在，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸更易吸附溶解在膜表面，從而促進其透過。解離態(tài)形式存在的綠原酸一方面由于道南效應(yīng)產(chǎn)生的電荷排斥不易進入膜表面，隨著乙醇濃度的增加，其在膜面的吸附溶解行為進一步減弱，所以在2種效應(yīng)的綜合作用下，綠原酸截留率顯著升高。

膜分離技術(shù)具有分離參數(shù)易控、分離行為重現(xiàn)性、參數(shù)可線性放大等技術(shù)優(yōu)勢，在對低濃度乙醇納濾分離時，需要注意納濾液中乙醇濃度的變化以及乙醇對納濾膜的溶脹損傷。在納濾處理含有低濃度乙醇溶劑時，進料液與納濾液中乙醇濃度未出現(xiàn)明顯變化，提示在傳統(tǒng)的精制分離產(chǎn)生的含低濃度有機試劑水溶液，可通過納濾分離技術(shù)處理，在去除溶質(zhì)成分的同時不改變?nèi)軇┍壤?，可提升生產(chǎn)分離效率。同時，在低濃度乙醇的浸泡下，納濾膜通量出現(xiàn)下降趨勢，說明膜材質(zhì)發(fā)生溶脹，納濾膜孔徑縮小，降低了膜通量提升了截留效率，但未對膜完整性產(chǎn)生明顯影響。

采用響應(yīng)面分析法中的BoxBehnken模式，對納濾濃縮參數(shù)進行優(yōu)化篩選，數(shù)學(xué)模型擬合程度高，實驗誤差小，且優(yōu)于傳統(tǒng)的減壓濃縮工藝，可用于實際生產(chǎn)預(yù)測。得到優(yōu)化工藝條件為：截留相對分子質(zhì)量450，乙醇濃度1600%，pH 600，在此條件下綠原酸截留率為9260%，通過對低濃度乙醇的納濾分離，不僅為中藥成分精制純化提供技術(shù)支撐，而且對于中藥資源的合理化利用及其制藥廢水處理帶來新的機遇。

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[責任編輯孔晶晶]