香青蘭總黃酮對ApoE—/—小鼠動脈粥樣硬化病變中TGFβ1/Smad信號通路及基質金屬蛋白酶表達的影響

劉楊　全翊寧　王新春　郭新紅　袁勇　曹文疆　程江

[摘要]研究香青蘭總黃酮（TFDM）對高脂飲食誘導載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠動脈粥樣硬化形成的影響及其相關機制。采用40只SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠予高脂飼料喂養，隨機分為5組：香青蘭總黃酮低、中、高劑量組分別給予21，42，84 mg·kg-1·d-1灌胃；辛伐他汀組灌服辛伐他汀35 mg·kg-1·d-1；模型組灌服等劑量生理鹽水。另設8只相同基因背景和周齡的雄性C57BL/6J小鼠為對照組予普通飼料喂養。各組均灌胃干預12周，采用HE染色觀察主動脈病理形態學變化；qRTPCR法檢測組織中TGFβ1，Smad2，Smad3，MMP2和MMP9基因的水平。實驗結果顯示：與模型組比較，HE染色觀察TFDM給藥組表現主動脈粥樣硬化組織損傷明顯減輕；TFDM不同劑量組可在一定程度上抑制高脂飼料誘導的ApoE-/-小鼠主動脈TGFβ1，Smad2，Smad3，MMP2，MMP9 mRNA的表達，且呈現一定的劑量依賴關系趨勢。提示TFDM具有減緩小鼠動脈粥樣硬化形成的作用，其作用機制可能與干預TGFβ1/Smad信號轉導有關。

[關鍵詞]動脈粥樣硬化； 香青蘭總黃酮； TGFβ1/Smad； MMPs

[Abstract]To investigate the effect and mechanism of Dracocephalum moldovica total flavones （TFDM） on the formation of atherosclerosis ApoE-/- mice induced by high fat diet A total of 40 SPF 8weekold male ApoE-/- mice were fed with high fat diet and randomly divided into 5 groups TFDM high， medium， lowdose group were given 21， 42， 84 mg·kg-1·d-1 by gavage； Simvastatin group was fed with simvastatin 35 mg·kg-1·d-1； and model group was given the same dose of normal saline The other eight male C57BL/6J mice of the same genetic background and age were set up as control group and fed with common diet All of the groups were intragastrically intervened for 12 weeks The aortic pathologic changes were observed with HE； qRTPCR was adopted to detect TGFβ1， Smad2， Smad3， MMP2 and MMP9 gene levels in tissues Compared with model group， HE staining in TFDM group showed obvious relief of aortic atherosclerotic tissue injury； each TFDM group showed inhibition in mRNA expressions of TGFβ1， Smad2， Smad3， MMP2 and MMP9 This suggests that TFDM can inhibit atherosclerosis formation， which may be related to the intervention of TGFβ1/Smads signal transduction

[Key words]atherosclerosis； Dracocephalum moldovica total flavones； TGFβ1/Smad； MMPs

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種脂質介導的慢性血管炎性病變，是眾多心、腦血管疾病發生和發展的重要病理基礎，可對人類健康產生嚴重危害。TGFβ/Smad通路在AS的發生發展過程中發揮著重要的作用，TGFβ具有多種生物學的功能，其對動脈內皮的損傷，血管平滑肌的遷移，動脈壁脂質聚集，細胞外基質的沉積和炎性細胞的浸潤等AS的關鍵步驟均有調節作用[13]。

香青蘭Dracocephalum moldovica L，為唇形科青蘭屬植物，是維吾爾民族藥之一，主要用于治療氣管炎、心臟病、高血壓等疾患，具有補腦安神、活血化瘀、通路開竅、鎮咳止喘等作用[4]。其主要化學成分有黃酮類、揮發油、萜類、氨基酸、微量元素及多肽等，香青蘭總黃酮（D moldavuca total flavones，TFDM）為香青蘭的主要有效成分，具有降血脂、抑制血小板聚集及保肝、抗炎等作用[57]。本研究應用高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠建立AS動物模型，采用HE染色觀察TFDM對主動脈斑塊面積的干預作用，以及qRTPCR檢測小鼠主動脈TGFβ1，Smad2，Smad3，MMP2和MMP9 mRNA的表達探討TFDM的抗AS作用及其可能機制。

1材料

11動物

SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠及8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）20120001。

12藥物和試劑

香青蘭總黃酮（新疆自治區藥物研究所，批號20131109）；辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號L019738）；膽固醇（北京索萊寶科技有限公司，批號108D102）；RNA提取試劑盒、DNA maker I（北京天根生物化科技有限公司）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo）；qRTPCR試劑盒（QIAGEN）；引物由上海生工公司合成。

13儀器

Mastercycler梯度PCR儀（美國 BioRAD公司）；216K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；XW80A漩渦混合器VORTER（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；TDZ5WS多管架自動平衡離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

2方法

21動物分組

適應性喂養2周后，將40只SPF級8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為5組，即模型組（給予相應生理鹽水）、香青蘭總黃酮高劑量組（84 mg·kg-1·d-1）、香青蘭總黃酮中劑量組（42 mg·kg-1·d-1）、香青蘭總黃酮低劑量組（21 mg·kg-1·d-1）和辛伐他汀陽性對照組（35 mg·kg-1·d-1），每組8只。另設8只相同基因背景和周齡的雄性C57BL/6J正常小鼠為空白對照組。

22模型制備

空白對照組喂養普通飼料，模型組、辛伐他汀組和TFDM組均給予喂養高脂飼料（075%膽固醇、15%豬油、8425%基礎飼料），并每日灌胃相應劑量的藥物；所有動物自由飲水，連續喂養12周。

23主動脈AS斑塊面積的測定

打開小鼠胸腔及腹腔，從主動脈根至腹主動脈末端處分離整條主動脈，4%多聚甲醛固定后在4 ℃冰箱內過夜，次日常規脫水、石蠟包埋并連續切片，切片厚度5 μm制作石蠟切片，HE常規染色后，于光學顯微鏡下檢測主動脈病理形態的變化。

24qRTPCR檢測相關基因的表達

241總RNA的提取取-80 ℃凍存的主動脈組織標本置液氮中迅速磨碎，依照天根公司的動物組織總RNA提取試劑盒說明，提取各實驗組組織總RNA。紫外分光法確定總RNA的含量和純度，測定樣品260，280 nm處的吸光度A，計算A260/A280及總RNA濃度，選取該比值在18～20的總RNA進行逆轉錄實驗。

242逆轉錄合成cDNA使用前每個組份輕輕混勻，然后2 000 r·min-1離心20 s；取滅過菌且無酶的02 mL PCR管，依次加入總RNA 1 μL，Oligo（dT）18 primer 1 μL，再加RNaseFree ddH2O至總體積12 μL。將上述混合液用漩渦振蕩器混勻，離心后孵育70 ℃ 5 min，然后放在冰上冷卻2 min；然后繼續往02 mL PCR的管中依次加入RNase抑制劑1 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTPs Mix 2 μL，RT 1 μL，再加雙蒸水至總體積20 μL。輕輕混勻后，然后2 000 r·min-1離心20 s；先在42 ℃保溫60 min，然后70 ℃變性5 min，然后置于冰上5 min；上述產物可立即進行下一步的PCR反應或-20 ℃保存。

243qRTPCR反應于八聯管依次加入：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，QN ROX Relerence Dye 01 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各05 μL，cDNA 1 μL，RNaseFree ddH2O 79 μL，共20 μL，混勻。引物信息見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。qRTPCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，重復40個循環。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。每份樣本平行設置4個復孔，另外設立βactin做內參對照，由熔解曲線檢測擴增產物的特異性，取其循環閾值（Ct）均值，利用qRTPCR測得的目的基因和參照基因的Ct值。

244計算樣本相對表達量將獲得的目的基因和參照基因Ct值求平均值后處理，利用相對定量法計算樣本相對表達量，處理組目的基因相對于空白組目的基因的量通過公式2ΔΔCt計算得到。

25統計學分析

運用SPSS 200軟件，參數值用±s表示，采用OneWay ANOVA方差分析進行統計處理，組間比較采用t檢驗，P<005表示有顯著性差異。

3結果

31香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊病理變化影響

HE染色結果顯示，正常對照組小鼠主動脈的內皮細胞形態完整，動脈中膜平滑肌細胞排列整齊，形態規則，無AS病灶；而模型組和各給藥組小鼠均有不同程度的AS病變產生。模型組可見體積較大的斑塊形成，斑塊內存在大量脂質、泡沫細胞沉積，內膜明顯增厚，纖維帽薄、脂質核心較大，斑塊突入管腔，導致管腔明顯狹窄。辛伐他汀治療組及香青蘭總黃酮治療組可見內皮細胞尚完整，斑塊體積較小，稍隆起，少量脂質與泡沫細胞沉積導致血管內膜局部增厚，無明顯管腔狹窄。提示香青蘭總黃酮對主動脈粥樣硬化斑塊有一定的穩定作用，見圖1。統計結果顯示，給藥組和模型組小鼠主動脈斑塊面積、管腔面積均無顯著性差異，香青蘭總黃酮高、中劑量組及辛伐他汀陽性藥物組斑塊面積與管腔面積比低于模型組，且差異具有顯著性（P<005），提示香青蘭總黃酮可明顯減少動脈粥樣硬化斑塊面積，見表2。

32香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA表達水平的影響

隨著TFDM藥物劑量增加，TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA表達下調。與正常組相比，模型組主動脈組織中的TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA的含量表達明顯升高，具有顯著性差異（P<005）。與模型組相比，TFDM各劑量組與辛伐他丁組對TGF

33香青蘭總黃酮對ApoE-/-小鼠主動脈MMP2，MMP9的mRNA表達水平的影響

隨著TFDM藥物劑量增加，MMP2，MMP9 mRNA表達下調。與正常組相比，模型組MMP2，MMP9 mRNA的含量明顯升高，具有顯著性差異（P<005）。與模型組相比，辛伐他汀組和TFDM各劑量組對MMP2，MMP9 mRNA的表達呈劑量依賴性降低（P<005，P<001），見圖3。

4討論

AS是一種累及全身大、中動脈內膜的慢性炎癥性疾病，目前認為，動脈粥樣硬化是由單核/淋巴細胞黏附并激活內皮細胞而開啟的由多種原因導致的疾病。隨著研究的深入，發現介導細胞因子活性的信號通路在AS的發生、發展中有重要作用。對這些細胞因子及信號通路的廣泛研究將有助于尋找新的抗AS藥物，并進一步從分子水平研究藥物抗AS的作用機制[89]。

本實驗研究中選用的ApoE-/-小鼠，是目前公認的進行藥物抗動脈粥樣硬化活性篩選及作用機制的最經典的動物模型之一[10]，而C57BL/6J小鼠與其具有相同的遺傳背景，在研究中常作為正常組。ApoE-/-小鼠在正常飲食及高脂飲食情況下血脂均會升高，且其發病機制與人類動脈粥樣硬化形成過程相似。已有研究報告[1112]，ApoE-/-小鼠在5～6周齡時主要是單核細胞趨附于損傷的內皮細胞處，8～10周齡出現脂紋，15～20周齡后逐漸出現纖維斑塊，病變部位以主動脈根最為明顯，其次為胸主動脈。本實驗中持續給予ApoE-/-小鼠高脂飼料喂12周即18周齡，HE染色可見模型組小鼠動脈發生動脈粥樣硬化斑塊沉積，TFDM組的病理改變程度均輕于模型組。

在動脈粥樣硬化的發生發展過程中，TGFβ/Smad通路具有雙向調節的作用。大量研究表明TGFβ對血管平滑肌細胞增殖、遷移及分化具有調節作用。在正常生理水平下，TGFβ具有抑制血管平滑肌的增生的作用[13]。但在炎癥以及損傷的病理狀態下，由于Smad3表達增加和MAPK途徑的激活，TGFβ具有促進血管平滑肌細胞增生，促纖維化的作用，從而促使內膜增生[1415]。實驗結果表明：在動脈粥樣硬化進程中，與正常組相比，模型組主動脈組織中的TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA的表達水平明顯升高，具有顯著性差異。與模型組相比，TFDM劑量組對mRNA的含量呈劑量依賴性降低（P<005）。提示TFDM可能通過下調TGFβ1和Smad2/3 mRNA的表達，抑制Smad2/3的核轉位，從而阻斷TGFβ1的信號轉導，抑制平滑肌細胞增生。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組同源的酶活性Zn2+和Ca2+依賴性的中性蛋白酶家族，其主要的生物學功能是特異性的與細胞外基質（ECM）各成分相結合，參與ECM的降解及重構，維持ECM的動態平衡，ECM不僅是血管壁的主要成分，也是影響粥樣斑塊纖維帽厚度和完整性，以及斑塊穩定性的重要因素[1617]。有研究表明，正常人和鼠的動脈血管VSMC均表達MMP9，但其活性在無損傷血管中檢測不到而損傷部位活化MMP9的表達明顯上調，并通過降解細胞外基質，促進血管平滑肌增殖和遷移，在動脈粥樣硬化的發生、發展和斑塊破裂的過程中發揮重要[18]。實驗結果顯示：與空白組比較，模型組MMP2，MMP9 mRNA的表達明顯較強，但TFDM各給藥組及辛伐他汀陽性藥物組能降低MMP2，MMP9 mRNA的表達，從而減少ECM降解，減輕血管重構；同時可以抑制損傷處的纖維帽變薄，從而降低了斑塊破裂的危險，增加了斑塊穩定性。

綜上所述，香青蘭總黃酮很有可能通過作用于TGFβ1/Smad信號轉導途徑，下調Smad2/3的表達，以及抑制MMP2和MMP9的表達，從而抑制平滑肌細胞的活化與增殖，增加斑塊的穩定性，延緩了AS的病理進程。信號轉導與疾病發生的關系是當今科學研究的熱點課題，更深層次上探討疾病發生的分子機制，通過干預信號轉導通路來防治疾病將會有良好的應用前景，TGFβ1/Smad信號通道有望成為動脈粥樣硬化藥物研究干預靶點，并在動脈粥樣硬化以及相關心血管疾病的治療中發揮其重要作用[19]。

[參考文獻]

[1]黃江偉，劉廠輝轉化生長因子β在動脈粥樣硬化中作用的研究進展[J]中國醫藥指南， 2013（6）：58

[2]張建平，嚴士海二苯乙烯苷抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的機理研究[J]中華中醫藥學刊，2015，33（9）：2086

[3]李娜，張新莊，王儼如，等基于網絡藥理學方法探討通塞脈片治療動脈粥樣硬化的作用機制[J]中國中藥雜志，2016，41（9）：1706

[4]袁勇，邢建國，王立萍，等香青蘭總黃酮在大鼠體內的藥代動力學研究[J]石河子大學學報：自然科學版，2014，32（1）：69

[5]Jiang J，Yuan X，Wang T， et al Antioxidative and cardioprotective effects of total flavonoids extracted from Dracocephalum moldavica Lagainst acute ischemia/reperfusioninduced myocardial injury in isolated rat heart[J] Cardiovasc Toxicol，2014，14（1）：74

[6]曹文疆，彭克軍，袁勇，等香青蘭總黃酮抗大鼠動脈粥樣硬化作用的初步研究[J]中國醫院藥學雜志，2013，33（19）：1570

[7]樊鑫梅，曹文疆，邢建國，等香青蘭總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究[J]中成藥，2013，35（8）：1625

[8]盧瓊，譚睿，崔文婷，等細胞信號通路與動脈粥樣硬化[J]中國醫藥生物科技，2012，7（3）： 211

[9]彭毅，邵紫韞，丁世芳動脈粥樣硬化中的細胞因子及細胞因子相關信號通路[J]中國動脈硬化雜志，2008，16（2）：161

[10]von Holt K， Lebrun S， Stinn W， et al Progression of atherosclerosis in the ApoE-/-model： 12month exposureto cigarette mainstream smoke combined with highcholesterol/fat diet[J] Atherosclerosis，2015，205（1）：135.

[11]徐芳，劉穎，齊潔阿托伐他汀對ApoE基因敲除小鼠血管外膜成纖維細胞表型的影響[J]中國生理病理雜志，2016，32（9）：1599

[12]祝娉婷，孫云，劉兆國半枝蓮總黃酮對ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化及磷脂轉運蛋白表達的影響[J]中國藥理學通報，2015，31（6）：833

[13]黃江偉，劉廠輝生長因子β在動脈粥樣硬化中作用的研究進展[J]中國醫藥指南， 2013（6）： 58

[14]Suwanabol P A， Seedial S M， Shi X， et al TGFβ increases vascular smooth muscle cell proliferation through the Smad3 and ERK MAPK pathways[J] J Vasc Surg， 2012， 56（2）： 446

[15]Ren M， Wang B， Zhang J， et al Smad2 and Smad3 as mediators of the response of adventitial fibroblasts induced by transforming growth factorβ1[J] Mol Med Rep， 2011， 4（3）： 561

[16]Chen Y F， Tsai H Y， Wu K J， et al Pipoxolan ameliorates cerebral ischemia via inhibition of neuronal apoptosis and intimal hyperplasia through attenuation of VSMC migration and modulation of matrix metalloproteinase2/9 and Ras/MEK/ERK signaling pathways[J] PLoS ONE， 2013，8（9）：e75654

[17]Dilme J F， Bellmunt S， Camacho M， et alInfluence of cardiovascular risk factors on levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 in human abdominal aortic aneurysms[J] Eur J Vasc Endovasc Surq，2014，48（4）：374

[18]Ni S W， Wang X F， Tang Z C Correlations between MMP2/MMP9 promoter polymorphisms and ischemic stroke [J] Int J Clin Exp Med， 2014， 7（2）： 400

[19]王文東轉化生長因子R/Smad3信號通路與動脈粥樣硬化[J]中國動脈硬化雜志，2011， 19（10）：875

[責任編輯張寧寧]