不同性別腦出血與凝血因子XIIIAPro564Leu基因多態性的關系

秦培英， 唐玉蘭， 黃 芩

原發性腦出血是發病率、致死率和致殘率極高的疾病，發病機制復雜。目前腦出血已知的高危因素不僅包括年齡、高血壓病、糖尿病等，而且與性別、遺傳因素有關，流行病學發現腦出血發病率男性多于女性。凝血因子XIII A亞單位(FXIIIA)Pro564Leu基因多態性與原發性腦出血的相關性研究［1～3］在近年屢有報道，但對于不同性別FXIIIAPro564Leu突變頻率及不同性別腦出血患者與FXIIIA Pro564Leu基因多態性的相關性研究報道較少。為此我們采用了聚合酶鏈反應和限制性片斷長度多態性技術對不同性別腦出血FXIIIA Pro564Leu基因多態性進行測定，探討FXIIIAPro564Leu在不同性別中的突變頻率，以及FXIIIA Pro564Leu基因多態性在不同性別腦出血發病中的作用和意義。

1 對象與方法

1.1 對象

腦出血組:收集2006年7月～2007年8月在廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科和神經外科住院的原發性腦出血患者，均符合全國第四屆腦血管疾病會議修訂的診斷標準，并經頭部CT或MRI證實，男性54例、女性26例，平均年齡59.6±13.7歲。對照組:選擇年齡、地域以及部分腦血管疾病危險因素等情況均與腦出血組基本匹配的未發生過腦血管疾病的男性55例和女性25例健康體檢者，平均年齡58.5±12.2歲。所選人群均無嚴重心、肝、腎及血液系統疾病，并排除有明確原因的繼發性腦出血者及血栓性疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據 Reiner［2］等設計的引物:上游引物:TCACCTTCTACACCGGGGTC G，下游引物:GACAGCGAGTCTCACAAAGAA。上游引物3’端G亦為一錯配堿基，原為C，因而在正常序列中引入了一個BstUI酶切位點(CGCG)，在Leu變異序列(CGTG)中無酶切位點。

1.2.2 基因型檢測 (1)人外周血白細胞基因組DNA提取清晨空腹采2ml外周靜脈血，經EDTA抗凝，酚/氯仿抽提法從血白細胞中提取DNA。(2)用聚合酶鏈反應和限制性片斷長度多態性技術(PCR-RFLP)進行基因型檢測 ①PCR反應體系:MgCl2、dNTPs(10mmol/L)各 2.0μl，10 × PCR buffer(MgCl2free)2.5μl，上、下游引物(5μmol/L)各0.5μl，TaqDNA Polymerase(5U/μl)0.125μl，基因組 DNA1.5μl，滅菌去離子三蒸水 15.875μl。②反應條件:預變性95℃4min;37個循環:94℃變性30s，55℃ 退火 38s，72℃ 延伸 30s，最后 72℃ 延伸5min。PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。③限制性內切酶分析:PCR產物10μl，限制性內切酶BstUI 10U，置于37℃恒溫水浴箱中消化過夜，反應體系總體積為20μl。取5μl消化后產物在3%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙錠染色。④產物檢測:以DNA/MspI Marker作為標準分子量，對PCR產物進行基因型鑒定。⑤序列測定:對野生型、雜合子突變、純合子突變者進行DNA片段測序。

1.2.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，基因型和等位基因頻率比較及風險評估采用χ2檢驗或 Fisher確切概率檢驗，關聯程度用比值比(OR)及95%可信區間(CI)表示。

2 結果

2.1 基因型的確定

PCR擴增產物為116bpDNA片段，在這個片段中存在1個BstUI酶切位點，可將此片段切成95bp、21bp兩個片段。當FXIIIA亞單位12號外顯子上的564號密碼子發生突變(C→T)，導致其編碼的脯氨酸被亮氨酸所替代時，PCR產物經BstUI酶切后瓊脂糖凝膠電泳只可見116bp一條帶;若為Pro564/leu564雜合子，則可見116bp、95bp和21bp 3條帶;若為Val564野生型，則可見95bp和21bp兩條帶(見圖1)。

圖1 FXIIIA Pro564Leu基因型凝膠電泳圖

2.2 不同性別FXIIIAPro564Leu基因型和等位基因頻率分析

男性腦出血組Leu 564等位基因頻率(23.15%)，明顯高于男性對照組(4.55%)(P ＜0.01);女性腦出血組Leu564等位基因頻率亦高于對照組(P＜0.05)。男性腦出血組與女性腦出血組間Leu564等位基因頻率比較無顯著差異(P＞0.05)，男性對照組與女性對照組間Leu564等位基因頻率比較亦無顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 不同性別FXIIIA Pro564Leu基因型和等位基因頻率分布［n(%)］

2.3 FXIIIAPro564Leu基因多態性與腦出血相對風險分析

男性及女性腦出血組Leu等位基因頻率均明顯高于對照組，有統計學意義。因此，我們對兩組人群的腦出血患者進行Pro564Leu基因多態性與腦出血相對風險分析。攜帶FXIIIAPro564Leu基因多態性者男性發生腦出血的危險性為野生型者的5.882倍(95%OR 可信區間 =2.013 ～17.192)，有統計學意義(P＜0.01);Pro/Leu基因型攜帶者發生腦出血的危險性是Pro/Pro基因型攜帶者的4.412倍(95%OR可信區間=1.466～13.279)，有統計學意義(P＜0.01);Leu/Leu基因型攜帶者發生腦出血的危險性是Pro/Pro基因型攜帶者2.471倍(95%OR可信區間 =1.906～3.202)，有統計學意義(P ＜0.01)。女性攜帶FXIIIAPro564Leu基因多態性者發生腦出血的危險性為野生型者的6.088倍(95%OR可信區間 =1.163 ～31.875)，有統計學意義(P ＜0.01);而Pro/Leu基因型攜帶者發生腦出血的危險性是Pro/Pro基因型攜帶者的8.118倍(95%OR可信區間=0.892 ～73.841)，有統計學意義(P ＜ 0.01);Leu/Leu基因型攜帶者與Pro/Pro基因型攜帶者相比OR值為 4.059倍(95%OR可信區間 =0.388～42.491)，但無統計學意義(P ＜0.01)。

2.4 腦出血組兩性各構成比

男性67.5%，女性32.5%，男性高于女性。

3 討論

腦出血是發病率、死亡率、致殘率極高的疾病，有資料顯示其發病率呈逐年上升趨勢［4，5］。目前已知其發病與環境、飲食、生活習慣、年齡、高血壓病、糖尿病、血脂異常等相關，而且與性別及遺傳因素也有關。腦出血發病率世界各國普遍存在性別之間的差別，從總體看，各年齡段男性發病率高于女性［6］，男性比女性高約25%。有認為男性與女性腦出血發病率的差異除與不同的生活習慣及內分泌因素有關外，尚有可能與不同的遺傳基因相關。近年發現凝血因子XIII(factorXIII，FXIII)A亞單位Pro564Leu(FXIIIA Pro564Leu)基因多態性與腦出血相關［1～3］。人凝血因子XIII (factorXIII、FXIII)又稱纖維蛋白穩定因子，是凝血過程中最后一步關鍵酶，有活性的凝血因子XIIIa能催化可溶性纖維蛋白交聯形成不溶性纖維蛋白多聚體，從而穩定纖維蛋白凝塊，使血凝塊不易被纖溶酶降解。FXIII A亞單位12號外顯子上564號密碼子C-T突變使脯氨酸轉變為亮氨酸，導致FXIII含量減少或活性降低而引起交聯纖維蛋白減少或催化形成的纖維蛋白結構不穩定易被纖維蛋白溶解酶溶解，從而導致了腦出血等不利后果［7］。不同性別間FXIIIPro564Leu多態性的差異及不同性別腦出血與Pro564Leu多態性的關系少見研究報道。

本研究通過對不同性別的病例--對照研究發現，不同性別腦出血組與對照組比較FXIIILeu564等位基因頻率有顯著的差異，腦出血組均較對照組高。不同基因型與腦出血的相關程度風險評估結果顯示，男性攜帶Pro564/Leu564雜合子型者及Leu564/Leu564純合子型者出現腦出血的危險性均較野生型者高，女性攜帶Pro564/Leu564雜合子型者出現腦出血的危險性亦較野生型者明顯升高，且差異均有統計學意義。提示無論男性還是女性，Pro564Leu多態性均為其腦出血的危險因素，與Reiner［3］及李正儀等人［8］研究的出血性卒中患者FXIIILeu564等位基因頻率明顯增高的結果一致，進一步證實攜帶有Pro564Leu基因型者可能增加腦出血的危險性，為腦出血的發病機制中有基因的參與提供了證據。但本研究顯示女性攜帶Leu564/Leu564與野生型者發生腦出血比值比為4.059，無統計學意義，尚不能推斷出女性攜帶Leu564/Leu564腦出血發生率與野生型者腦出血發生率有差異，與Reiner等人［3］發現年青女性白人出血性卒中C-T突變者明顯增多，攜帶有FXIIIPro564Leu突變者可增加3倍的出血性卒中的危險性結果部分不符。出現上敘述結果的原因可能是由于種族不同和女性組樣本量不足引起，有待增加樣本量、在不同地區和人群進一步的研究。

本研究還顯示腦出血組男性構成比明顯高于女性，提示同一時間段內，本地區患腦出血的男性可能多于女性，與流行病學顯示男性發病率高于女性發病率結果相符［6］。本研究還顯示男性及女性腦出血患者中FXIIILeu564等位基因頻率分別為23.15%、23.08%，兩組基因型及等位基因頻率分布無明顯差異;兩性各對照組FXIIILeu564等位基因頻率分別為4.55%、6.0%，兩組基因型及等位基因分布亦無明顯差異。提示FXIIIA Pro564Leu突變頻率不存在明顯性別差異，男女腦出血發病率不同可能與Pro564Leu多態性無關。

［1］ Gallivan L，markham AF，Anwar R，et al.The leu564 factor XIIIA variant results in significantly lower plasma factor XIIIl evels than the pro564 variant［J］.Thromb haemost，1999，82(4):1368 － 1370.

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