香樟果揮發(fā)性成分不同提取方法的氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析及其對神經(jīng)細(xì)胞活性的影響

楊錦強，楊念云，于 生，崔小兵，郭舒臣

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

·實驗研究·

香樟果揮發(fā)性成分不同提取方法的氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析及其對神經(jīng)細(xì)胞活性的影響

楊錦強，楊念云△，于 生，崔小兵，郭舒臣

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目的 利用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法分析并比較固相微波萃取法與水蒸氣蒸餾法提取香樟果中揮發(fā)性成分效果，并研究香樟果揮發(fā)性成分對神經(jīng)細(xì)胞活性的影響。方法 采用固相微波萃取法、水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性成分，GC－MS法分析和鑒定，并用歸一化法計算各成分相對百分含量；采用對照法研究水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)性成分對神經(jīng)細(xì)胞的活性。結(jié)果 2種方法提取的香樟果揮發(fā)性化學(xué)成分有差異。利用固相微波萃取從香樟果中分析鑒定出 26種化學(xué)成分，主要成分為 β－側(cè)柏烯（16.07%）、樟腦（14.31%）、3－蒈烯（13.70%）、桉葉油醇（11.53%）和莰烯（5.09%）；利用水蒸氣蒸餾從香樟果中分析鑒定出23種化學(xué)成分，主要成分為黃樟素（19.81%）、桉葉油醇（9.68%）和芳樟醇（5.88%）。香樟果揮發(fā)油質(zhì)量濃度為100μg／mL時能增強神經(jīng)細(xì)胞活性。結(jié)論 2種提取方法得到的香樟果揮發(fā)油成分，主要成分差異較大，可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的不同采取不同的提取方法。同時，固相微波萃取法提取香樟果揮發(fā)性成分，集萃取、進(jìn)樣于一體，操作簡單，重復(fù)性好，對香樟果的質(zhì)量控制有應(yīng)用價值。

香樟果；揮發(fā)性成分；氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法；固相微波萃取；水蒸氣蒸餾；神經(jīng)細(xì)胞活性

香樟 Cinnamomum camphora也稱樟樹，系樟科樟屬，屬于藥用植物[1－2]。樟樹的樹枝、樹葉、果實等富含揮發(fā)性成分，可芳香健脾。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，香樟可祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、行氣血，治療腳氣、心腹脹痛、痛風(fēng)、跌打損傷。目前對于香樟揮發(fā)油的研究主要集中在樟樹葉[3－4]，后者主要含桉葉素、芳樟醇、α－蒎稀、β－蒎稀、莰烯、黃樟素等揮發(fā)性成分。近年來關(guān)于香樟果揮發(fā)性成分的研究較少，而香樟果為可再生資源，應(yīng)用前景廣闊。為此，本試驗中采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法對比分析了固相微波萃取法和水蒸氣蒸餾法提取的香樟果揮發(fā)性成分及其相對含量，為進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。同時，本試驗中還研究了水蒸氣蒸餾法提取的香樟果揮發(fā)性成分對神經(jīng)細(xì)胞活性的影響[5]。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器

Agilent 7890B／7000C型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies 7697A型自動固相微萃取裝置（美國Agilent公司）。

1.1.2 試藥

試劑用水為超純水；甲醇（南京化學(xué)試劑股份有限公司）為色譜純；大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）。香樟果于2016年11月采自南京中醫(yī)藥大學(xué)，自然陰干，所有樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)楊念云副研究員鑒定，標(biāo)本保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)實驗室。

1.2 方法

1.2.1 固相微波萃取法

稱取2 g香樟果（經(jīng)粉碎），置15mL專用采樣瓶中，插入自動進(jìn)樣器，90℃下頂空萃取保持30min，自動插入色譜儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中，脫附1.5min。

1.2.2 水蒸氣蒸餾法

稱取1 000 g香樟果（經(jīng)粉碎），置5 000mL圓底燒瓶中，水蒸氣蒸餾2 h，收集揮發(fā)油（無色，有特殊香味）并取0.5m L以甲醇溶解。

1.2.3 GC－MS法

毛細(xì)管氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀器。氣相條件，HP－5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm），柱溫60℃（保持2min），以5℃／min的速率升溫至120℃，保持2min，再以5℃／min的速率升溫至280℃；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為高純度He（99.999%），載氣流速1 mL／min；進(jìn)樣量1μL，采用不分流方式進(jìn)樣；溶劑延遲3min。質(zhì)譜條件，電離方式為電子轟擊電離（EI），電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍 m／z30～500。

1.2.4 神經(jīng)細(xì)胞活性試驗

采用含雙抗和5%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，于 37℃及 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次傳代均以0.25%胰酶消化，洗滌1次，更換新培養(yǎng)基。傳代濃度為5×105／m L。將細(xì)胞分為正常對照組、溶劑對照組（含0.1%二甲基亞砜的DMEM培養(yǎng)液）及不同質(zhì)量濃度（25，100μg／m L）香樟揮發(fā)油給藥組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒法，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細(xì)胞上清液中神經(jīng)生長因子（NGF）的含量。

2 結(jié)果

通過以上試驗，分別得到不同方法的總色譜譜圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過工作站NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫和相關(guān)文獻(xiàn)[6－12]報道分析，鑒定出部分化合物。通過工作站對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，按照峰面積歸一化法計算各化合物的相對百分含量，結(jié)果見表1。神經(jīng)細(xì)胞活性試驗結(jié)果見表2。

由表1可見，固相微波萃取法提取的揮發(fā)性成分共分離出32個色譜峰，其中鑒定出了26個化合物，占總揮發(fā)性峰面積的87.01%。其中以不飽和烴（45.80%）和醚類（19.23%）為主，主要成分（相對百分含量＞5%）為 β－側(cè)柏烯（16.07%）、樟腦（14.31%）、3－蒈烯（13.70%）、桉葉油醇（11.53%）和莰烯（5.09%）。水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)性成分共分離出32個色譜峰，其中鑒定出了23個化合物，占揮發(fā)性組分峰面積的58.88%，其中以醚（31.77%）和不飽和烴（16.10%）為主，主要成分為黃樟素（19.81%）、桉葉油醇（9.68%）和芳樟醇（5.88%）。

表1 固相萃取香樟果揮發(fā)性成分的GC－MS分析

續(xù)表1 固相萃取香樟果揮發(fā)性成分的GC－MS分析

表2 神經(jīng)細(xì)胞活性比較

由表2可見，香樟果揮發(fā)性成分質(zhì)量濃度為100μg／mL時能增強神經(jīng)細(xì)胞活性。

3 討論

由鑒定出來的成分可見，2種方法得到的揮發(fā)油成分中，有14種化合物是2種提取方法得到的揮發(fā)油共有的，分別占 52.55%（固相微波萃取法）和52.50%（水蒸氣蒸餾法）。但提取的揮發(fā)油主要成分有明顯差異，固相微波萃取法得到的揮發(fā)油中β－側(cè)柏烯、3－蒈烯含量明顯高于水蒸氣蒸餾法得到的揮發(fā)油中的此類成分，而水蒸氣蒸餾法得到的揮發(fā)油中黃樟素的含量明顯高于固相微波萃取法得到的揮發(fā)油中的此類成分。

樟腦是世界上最早使用的天然有機化學(xué)成分之一，有興奮、強心、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、止咳、促滲、殺螨等藥理作用[13]。通過固相微波萃取法可得到較高含量的樟腦。黃樟素是白鼠和老鼠的致肝癌物，鑒于此，美國不允許將其作為食品添加劑[14－15]。通過水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油成分中，黃樟素的含量明顯降低。桉葉油醇對馬鈴薯莖蛾具有明顯的產(chǎn)卵引誘，對于馬鈴薯莖蛾的防治有著重要意義[16]。本研究中2種方法提取的揮發(fā)油中桉葉油醇的含量均較高。

本研究中分析并比較了固相微波萃取法和水蒸氣蒸餾法提取得到的香樟果揮發(fā)油的成分，主要成分差異較大，可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的不同采取不同的提取方法，為藥理研究和合理利用香樟果資源提供科學(xué)依據(jù)，研究同時發(fā)現(xiàn)，香樟果揮發(fā)油能增強神經(jīng)細(xì)胞的活性。此外，本研究中筆者首次采用固相微波萃取法提取香樟果揮發(fā)性成分，集萃取、進(jìn)樣于一體，操作簡單，重復(fù)性好，對于香樟果的質(zhì)量控制具有參考意義。

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Volatile O ils of Fruits of Cinnamomum Cam phora w ith Different Extraction M ethods by GC－M S and Its Effect on Nerve Cell Activity

Yang Jinqiang，Yang Nianyun，Yu Sheng，Cui Xiaobing，Guo Shuchen
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210023）

Objective To analyze and compare the methods of solid－phase microextraction（SPME）and steam distillation for extracting volatile oils from fruits of Cinnamomum Camphora by GC－MS and to study its effect on nerve cell activity.M ethods The volatile oils were extracted by SPME and steam distillation，analyzed and identified by GC－MS.The compounds were quantitatively determined by normalization method.The effect of volatile oils extracted by steam distillation on nerve cell activity was study by contrast method.Resu lts The main volatile compounds extracted from fruits of Cinnamomum Camphora by the 2 methods were different.Totally 26 compounds were identified by SPME from fruits of Cinnamomum Camphora.The major chemical constituents wereβ－thujene （16.07%），camphor（14.31%），3－carene（13.70%），eucalyptol（11.53%）and camphene（5.09%）.Totally 23 compounds were identified by steam distillation from fruits of Cinnamomum Camphora.The major chemical constituents were safrole（19.81%），eucalyptol（9.68%）and linalool（5.88%）.The volatile oils at the concentration of 100μg／m L could enhance the activity of nerve cells.Conclusion The main volatile compounds extracted from fruits of Cinnamomum Camphora by the 2 methods were different，different extraction methods can be adopted according to different target products.Meanwhile，the extraction of volatile components of Cinnamomum Camphora by SPME is a combination of extraction and sample introduction.It has simple operation，good repeatability，and practical value for the quality control of Cinnamomum Camphora.

Cinnamomum Camphora；volatile oil；GC－MS；SPME；steam distillation；nerve cell activity

R284.1；R285.5；R282.71

：A

：1006－4931(2017)12－0023－04

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.006

楊錦強，在讀碩士研究生，研究方向為天然藥物生產(chǎn)加工與品質(zhì)評價，（電子信箱）13770676634＠163.com。

△通訊作者：楊念云，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥天然藥物資源化學(xué)研究，（電子信箱）nianyunyang＠163.com。

2017－01－06；

2017－02－07)