定性、定量方法測定養血注射液溶血性試驗

侯超

（鄭州市中醫院制劑室，河南 鄭州 450000）

定性、定量方法測定養血注射液溶血性試驗

侯超

（鄭州市中醫院制劑室，河南 鄭州 450000）

目的：觀察養血注射液溶血作用。方法：肉眼觀察法定性觀察養血注射液的溶血性；同時采用分光光度法、體外紅細胞計數法定量計算養血注射液的溶血率。結果：肉眼觀察法中，養血注射液溶血作用較弱；分光光度法中，養血注射液溶血率低于3.5%；體外紅細胞計數法中，養血注射液溶血率低于5%。結論：養血注射液溶血作用符合國家標準。

養血注射液；溶血試驗；肉眼觀察法；分光光度法；體外紅細胞計數法

養血注射液是以四物湯中有效成分為原料藥，配伍甘油等附加劑制備而成的化學結構明確、療效確切的注射液，具有補血、養血、活血的功效，為了考察注射液的安全性，本試驗開展了溶血性試驗，為新藥研發奠定基礎。

1 儀器、試藥與試驗動物

1.1 儀器

UV-4802型雙光束紫外可見分光光度計（尤尼克儀器有限公司）；POCH-100 ivd型全自動動物血液分析儀（希森美康醫用電子有限公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）；抗凝管（江蘇康健醫療用品有限公司）；錐形瓶；移液槍；離心管；試管；鑷子。

1.2 試藥

0.9 %氯化鈉溶液（福州海王福藥制藥有限公司）；養血注射液由福建中醫藥大學藥劑科研實驗室自制，蒸餾水由福建中醫藥大學藥學院自制。

1.3 動物

昆明小鼠，清潔級，合格證號：SCXK（滬）2012-0002，福建中醫藥大學動物房提供，雌雄各半，18～22 g。

2 試驗方法與結果

2.1 肉眼觀察法定性觀察

2.1.1 2%紅細胞懸浮液的配制 采用抗凝管取健康小鼠血液3 mL，混勻，轉移至10 mL離心管內，加1倍量0.9%氯化鈉溶液，搖勻，1000～1500 r/min離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細胞再加入0.9%氯化鈉溶液約5倍量，搖勻，1000～1500 r/min離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細胞再加入0.9%氯化鈉溶液5倍量按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液制成2%（V/V）的混懸液，供試驗用。

2.1.2 定性觀察[1-3]取潔凈試管7只，進行編號，1～5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，7號管為陽性對照管。按下表所示依次加入2%紅細胞懸液，0.9%氯化鈉溶液或蒸餾水，混勻后，立即置（37±0.5）℃的水浴鍋中進行溫育，并于第15 min，30 min，45 min，1 h，2 h及3 h觀察溶血與凝聚反應。按表1中順序加入各種溶液。

表1 試驗安排 （mL）

2.1.3 結果判定 溫育的過程中，若試管中的溶液呈澄明紅色，管底無細胞殘留或有少量紅細胞殘留，表明有溶血發生；如試管下部為紅色紅細胞懸浮液，上部液體無色澄明，表明無溶血發生。

若供試品管紅細胞沉降較對照管明顯快，表明有紅細胞凝聚發生。如有紅細胞凝聚的現象，可按下法進一步判定是真凝聚還是假凝聚。若凝聚物在試管振蕩后又能均勻分散，或將凝聚物放在載玻片上，在蓋玻片邊緣滴加2滴0.9%氯化鈉溶液，置顯微鏡下觀察，凝聚紅細胞能被沖散者為假凝聚，若凝聚物不被搖散或在玻片上不被沖散者為真凝聚。

2.1.4 試驗結果 按照“2.1.1”～“2.1.3”中的試驗方法，重復做3批，溫育3 h后定性觀察。結果見圖1。

圖1 3批注射液溶血試驗肉眼觀察

15 min時，3批樣品1～6號試管均在液面約0.2 cm處出現分層，下部為紅細胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號試管為澄明紅色，不分層。

30 min時，3批樣品1～6號試管均在液面約0.3 cm處出現分層，下部為紅細胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號試管為澄明紅色，不分層。

45 min時，3批樣品1～6號試管均在液面約0.5 cm處出現分層，下部為紅細胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號試管為澄明紅色，不分層。

1 h時，3批樣品1～6號試管均在液面約0.6 cm處出現分層，下部為紅細胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號試管為澄明紅色，不分層。

2 h時，3批樣品1～6號試管均在液面約1.2 cm處出現分層，下部為紅細胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號試管為澄明紅色，不分層。

3 h時，3批樣品1～6號試管均在液面約2 cm處出現分層，下部為紅細胞懸浮液，上部為澄明溶液，顏色微紅；7號試管為澄明紅色，不分層。

2.2 分光光度法定量計算

2.2.1 定量計算 按表1將溫育了3 h后的各管溶液離心，取上清液，在分光光度計545 nm處，以蒸餾水為空白讀取各管的吸光度值（OD）值。

2.2.2 結果判定 根據紅細胞破裂釋放出來的血紅素在可見光波長段具有最大吸收的原理，采用分光光度法測定中藥注射劑的溶血程度，可用下列公式計算各試驗管的溶血率。

溶血率（%）＝（ODt－ODnc）/（ODpc－ODnc）×100%

式中，ODt：試驗管吸光度；ODnc：陰性對照管吸光度；ODpc：陽性對照管吸光度。

2.2.3 試驗結果 按照“2.1.1”～“2.1.3”以及“2.2.1”～“2.2.2”中的試驗方法，重復做3批，溫育3 h后，定量計算結果見表2，表3。

表2 3批試驗定量計算結果（吸光度）

表3 3批試驗定量計算結果（溶血率）

注：溶血率（%）＝[(空白對照管紅細胞數-供試品管紅細胞數)/空白對照管紅細胞數]×100%

2.3 體外紅細胞計數法定量計算

2.3.1 小鼠10只，摘眼球取血，將所采血液置抗凝管中，混勻，共5 mL，待用。

2.3.2 取5 mL試管6只，編號，1～4號管為供試品管，5號管為空白對照管，6號管為陰性對照管。見表4。

表4 試驗安排 （mL）

按表4依次加入血液、養血注射液、生理鹽水，混勻，分別于第15 min，30 min，1 h，2 h，4 h及8 h后進行血常規檢查，得紅細胞（RBC）數值，并計算溶血率。

2.3.3 按照“2.3.1”和“2.3.2”中的試驗方法，重復做3批，結果見表5和表7。

表5 體外紅細胞計數法第1批試驗數據

表6 體外紅細胞計數法第2批試驗數據

表7 體外紅細胞計數法第3批試驗數據

3 討論

3.1 肉眼觀察法

3批樣品中，7號試管均一直為澄明紅色，不分層，表明發生溶血。1～6號試管中紅細胞隨著時間的延長而逐漸沉淀下部，上部液體澄清，并且1～5號供試品管上部澄明液體顏色與6號陰性對照管上部澄明液體顏色一致，表明養血注射液的溶血作用較弱。

3.2 分光光度法

3批樣品中，采用分光光度法測定養血注射液的溶血程度，進行定量計算。結果1～5號供試品管的溶血率均低于3.5%，表明養血注射液的溶血作用較弱。為了增加可靠性，該溶血試驗連做3批，結果3批溶血率均低于3.5%，符合國家溶血不得＞5%規定的要求[4]，且穩定性好，表明養血注射液溶血作用較弱，安全性較好。

3.3 體外紅細胞計數法

通過測定6號陰性對照管中RBC的值為0，表明養血注射液對血液測定無干擾。3批樣品中，1～4號管的溶血率均符合國家溶血率不得＞5%規定的要求，且隨著時間的推移，溶血率并沒有升高，表明養血注射液溶血性較弱，安全性較好。

本試驗在經典肉眼觀察法定性觀察注射液溶血性的基礎上，進一步通過分光光度法、體外紅細胞計數法定量計算注射液的溶血率[5-7]，使得試驗方法更科學、嚴謹，試驗數據更有說服力。

[1] 姜允申,肖杭,唐玲芳.巰甲丙脯酸的血管刺激與溶血試驗[J].海峽藥學,1994,6(2):20-21.

[2] 吳國土,林秀珍,林建忠,等.注射用司帕沙星的溶血試驗[J].海峽藥學,2003,15(4):25-26.

[3] 曹繼軍.乳酸左氧氟沙星注射液溶血試驗[J].中國冶金工業醫學雜志,2007,24(3):338-339.

[4] 《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則》課題研究組[S].2005:25.

[5] 韓雪松,劉瑩,戰德松.溶血試驗評價奧氏體無鎳不銹鋼生物相容性[J].沈陽醫學院學報,2010,12(2):87-89.

[6] 吳婷,王文佳,李薇.丹參川芎嗪注射液溶血試驗及體外細胞毒性分析[J].今日藥學,2014,24(10):716-718.

[7] 李逢春.鹽酸氨溴索注射液安全性評價研究[J].中國實用醫學,2014,9(19):258-259.

本文編輯：魯守琴

Qualitative and Quantitative Tests for Hemolysis of Yangxue Injection

Hou Chao
(Manufacturing Laboratory, Zhengzhou Hospitol of Traditional Chinese Medicine, Henan Zhengzhou 450000, China)

Objective：To observe Hemolytic effect of Yangxue Injection.Methods：The hemolysis of yangxue Injection was observed visually, while the hemolysis rate was determined by spectrophotometry and red blood cell count in vitro.Results：Weak hemolysis was observed visually. However, the hemolysis rate was less than 3.5% by spectrophotometry, and less than 5% by red blood cell count in vitro.Conclusion：Hemolytic effect of yangxue injection is in line with national standards.

Yangxue Injection; Hemolysis Test; Visual Observation; Spectrophotometry; Red Blood Cell Count in Vitro

R927

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.05.015

2017 - 04 - 04

侯超，男，碩士，中藥師。研究方向：中藥制劑與質量控制。E-mail：18838195935@163.com