缺氧對血府逐瘀膠囊促血管新生影響的研究

蔡飛，蘇曉艷，王鶴，秦崇濤，宋軍，高冬

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122；2.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京100700）

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缺氧對血府逐瘀膠囊促血管新生影響的研究

蔡飛1，蘇曉艷2，王鶴1，秦崇濤1，宋軍2，高冬1

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建福州350122；2.中國中醫科學院醫學實驗中心，北京100700）

目的研究血府逐瘀膠囊在缺氧條件下對血管新生的影響。方法通過觀察血府逐瘀膠囊含藥血清在缺氧條件下對HMEC-1細胞的活力、增殖能力、黏附能力、遷移能力和體外成血管能力的影響，明確缺氧條件對藥物促血管新生作用的影響。結果缺氧條件下含藥血清在低濃度早、中期增加HMEC-1細胞活力，提高遷移及黏附能力；中、高濃度含藥血清早期促進血管管腔形成，隨后促管腔形成作用消失。結論缺氧條件下血府逐瘀膠囊通過影響HMEC-1細胞活力、遷移、黏附能力等環節來保護血管內皮細胞，促進血管新生。

血府逐瘀膠囊；血管新生；缺氧

缺血性疾病系由各種原因導致動脈或靜脈的血流不足或中斷，致使相應的組織和器官出現不同程度的缺氧缺血損傷，而產生臨床上相對應的組織、器官、神經等功能缺失的表現。近年來，缺血性疾病嚴重危害著人類健康，血管新生在缺血性疾病的治療和愈后中意義重大［1］。血管新生通常發生在營養不足或缺血缺氧等病理條件下，因此本實驗意在通過在缺氧培養條件下，觀察血府逐瘀膠囊含藥血清對人微血管內皮細胞HMEC-1活力、增殖、黏附、遷移和形成管腔的影響，探討血府逐瘀膠囊在缺氧條件下對血管新生的影響及其促血管生長的行為特征，從細胞水平明確藥物促進血管新生的作用機制，也為血府逐瘀膠囊的臨床使用提供有力的科學理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及細胞株SPF級SD雄性大鼠40只，6周齡，體重（150±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供（NO.0037614），由福建中醫藥大學實驗動物中心［許可證號：SYXK（閩）2009-0001］飼養。HMEC-1細胞株由中科院上海藥物研究所丁健院士惠贈。

1.2 實驗藥物血府逐瘀膠囊由天津宏仁堂藥業有限公司生產，0.4 g／粒，藥品批號為A03149。用生理鹽水溶解配制成濃度為0.041 g／mL的藥液。

1.3 試劑及儀器胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），體外血管生成試劑盒（美國Millipore公司），循環測試DNA試劑盒（美國BD公司），MCDB-131培養基（美國GIBCO公司），MTT（美國Sigma公司），結晶紫細胞群落染色試劑盒（上海捷美基因公司），DMSO（北京Solarbio公司），FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司），8000系列水套三氣厭氧培養箱（美國Thermo scientific），IX70倒置相差顯微鏡及數碼攝像裝置（日本Olympus公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組和含藥血清制備SPF級SD雄性大鼠40只，隨機分為藥物組和空白組，每組20只。藥物組以血府逐瘀膠囊藥液灌胃，給藥劑量為每天0.41 g／kg，相當于臨床常用劑量的2倍；空白組以等量生理鹽水灌胃。連續灌胃7天，2次／天，第8天灌胃后2 h腹主動脈采血，離心分離血清，56℃水浴鍋滅活，過濾除菌，分裝，置于-20℃冰箱保存備用。

2.2 細胞培養將HMEC－1細胞培養于含10% FBS的MCDB-131培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

2.3 實驗分組干預接種4 h細胞貼壁后更換含不同濃度的空白血清和含藥血清MCDB-131培養液，具體干預分組如下：1.25%、2.5%、5%含藥血清組與1.25%、2.5%、5%空白血清組，置于缺氧培養箱中培養24 h、48 h、72 h后開展各項實驗。

2.4MTT實驗按0.5×104個／mL接種于96孔細胞培養板，分組干預后，置缺氧培養箱培養24 h、48 h、72 h，每孔加入5 mg／mL的MTT溶液20 μL，置于原培養條件4 h，棄培養液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，置于主波長為570 nm、參比波長為630 nm的酶標儀中，測定各孔的吸光度值（OD值）。每組設為6個平行孔，重復3次。

2.5 細胞周期檢測按5×105個／mL接種于直徑10 cm的培養皿中，分組干預后，置缺氧培養箱培養24 h、48 h、72 h，根據循環測試DNA試劑盒說明書操作。使用FACSCAN流式細胞儀檢測處于S期細胞所占比例，ModiFit軟件分析。實驗重復3次。

2.6 細胞黏附實驗按2×105個／mL細胞密度接種于6孔細胞培養板，分組干預后，置缺氧培養箱中培養24 h、48 h、72 h，胰酶消化收集，稀釋至2× 104個／mL的細胞密度，毎孔100 μL接種于96孔細胞培養板，原培養條件培養1 h后，棄培養液，按照結晶紫細胞群落染色試劑盒說明書操作，固定15 min，染色20 min，晾干后拍照，計數黏附的細胞。每組設有6個平行孔，實驗重復3次。

2.7 細胞遷移實驗按2×105個／mL細胞密度接種于6孔細胞培養板，分組干預后，置缺氧培養箱中培養24 h、48 h、72 h。①在Transwell室孔中加入培養液，37℃、5%CO2培養箱培養1 h；②取出缺氧培養箱中細胞，棄原培養液，消化收集成單細胞懸液，稀釋為2×105個／mL的細胞懸浮液；③將細胞懸浮液按100 μL／室加入至培養1 h后的Transwell小室，置缺氧培養箱培養12 h后，取出Transwell小室，按結晶紫細胞群落染色試劑盒說明書操作，計數遷移的細胞數量。每組設有3個小室，實驗重復3次。

2.8 體外成血管實驗按2×105個／mL細胞密度接種于6孔細胞培養板，分組干預后，置缺氧培養箱中培養24 h、48 h、72 h，按體外血管生成試劑盒說明書操作后，置于缺氧培養箱中培養4 h，拍照，計數管腔形成數。設3個平行孔，實驗重復3次。

2.9 統計學方法所有實驗數據用SPSS 22.0軟件分析處理，計量資料用（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 缺氧對細胞活力影響比較缺氧條件下低濃度含藥血清短時間能顯著增加細胞活力，見表1。

表1 缺氧對細胞活力影響比較（x±s，n＝6）

3.2 缺氧對細胞增殖能力比較缺氧條件下，藥物對細胞增殖沒有影響，見表2。

3.3 缺氧對細胞遷移情況比較在缺氧條件下，藥物低濃度早期促進細胞遷移，中濃度先抑制后促進細胞遷移，而高濃度中期促進細胞遷移，最終作用消失，見表3。

3.4 缺氧對細胞黏附情況比較在缺氧條件下，中濃度藥物促進細胞黏附，高濃度抑制細胞黏附，見表4。

表2 缺氧對細胞增殖能力比較（x±s，n＝3）

表3 缺氧對細胞遷移情況比較（x±s，n＝6）

表4 缺氧對細胞黏附情況比較（x±s，n＝6）

3.5 缺氧對細胞體外血管腔形成能力比較在缺氧環境下，中、高濃度血府逐瘀膠囊能夠在作用較早期促進血管管腔形成，隨后促管腔形成作用消失，見表5。

表5 缺氧對細胞體外血管腔形成能力比較（x±s，n＝18）

4 討論

血府逐瘀湯是清代醫家王清任活血化瘀法最具代表性的方劑。該方由桃仁、紅花、生地、當歸等11味中藥組成，血府逐瘀膠囊是按照該藥物組成而生產的膠囊制劑，目前在臨床上被廣泛用于各種缺血性疾病的防治［2］，如冠心病、缺血性腦血管病、動脈粥樣硬化等，還用于輔助治療腫瘤［3］。早期藥理學研究表明，血府逐瘀湯可改變血液凝固性和血液流變性，具有舒張血管、降低血管阻力、改善毛細血管通透性、保護心肌細胞等多種藥理作用［4］。因此，我們在此基礎上開展的系列研究發現，高劑量的血府逐瘀湯通過NO誘導內皮祖細胞遷移至缺血區，發揮促血管新生的作用，改善了局部缺血壞死的狀況，避免了患肢出現肌肉萎縮［5］。而本實驗從體外細胞模型發現在缺氧條件下血府逐瘀膠囊可以增加HMEC-1細胞活性，提高細胞遷移、黏附和體外血管腔形成能力，通過多環節調節血管新生，為血府逐瘀膠囊治療缺血性疾病的臨床運用提供了細胞水平的作用機制以及更多的實驗依據。

本課題組前期開展了一系列血府逐瘀湯在常氧條件下促血管生長的實驗研究，結合本實驗缺氧條件的研究，進一步肯定了藥物促血管新生的作用，而且更全面豐富了藥物影響血管生長的認識。通過比較本實驗缺氧條件與前期非缺氧條件的細胞實驗結果［6-7］，我們發現缺氧條件下1.25%藥物血清作用24 h、48 h可增強細胞活力，而常氧條件下藥物增強細胞活力僅發生在2.5%濃度作用48 h。另外，缺氧條件下1.25%藥物血清作用24 h、2.5%濃度作用48 h、72 h和5%濃度作用48 h，均可促進細胞遷移，而常氧條件下含藥血清促進細胞遷移發生在2.5%、5%濃度作用48 h，說明藥物在缺氧條件下對細胞活性和遷移的促進作用出現在更低濃度和更早的作用時間。缺氧條件下2.5%和5%含藥血清僅在干預24 h出現短暫的促血管形成的作用，而常氧條件下藥效時間點推遲到48 h，且高濃度5%含藥血清干預72 h會抑制血管形成，表現出短暫促血管生長以及對血管生長的雙向調節作用。上述結果提示藥物只能短暫地促血管生長，且其作用方式與生理條件的變化密切相關。

另外研究發現缺氧會造成細胞凋亡率增加［8-10］，細胞形態發生改變，出現壞死，活性降低［11］，并可抑制細胞增殖［8，11］。石曉明等［12］還發現低氧處理ECV304細胞24 h、48 h、72 h，處于G0／G1期的細胞均顯著增加，S期細胞明顯減少，在抑制細胞增殖的同時還抑制細胞遷移和體外形成血管腔［13］。在大鼠心肌微血管內皮細胞進行缺氧處理也發現相同的實驗結果［14］。這些實驗說明缺氧會抑制細胞的活力，增殖、遷移、黏附及管腔形成能力，而本實驗結果血府逐瘀膠囊增強細胞的活力，促進細胞遷移、黏附和管腔的形成，并消除缺氧對細胞增殖的抑制作用，從側面說明了血府逐瘀膠囊在缺氧條件下對血管內皮細胞的保護作用，顯示出血府逐瘀膠囊用于各種缺血性疾病的防治的優點。目前對于缺氧與血管新生的研究顯示，在缺氧條件下VEGF［15-16］、腺苷［17］、HIF、趨化因子等調控因子及其介導的如：Notch／Dll4、cAMP-PKA-CREB等信號通路都與血管新生密切相關，但是在缺氧條件下血府逐瘀膠囊促血管新生作用機制是否也與這些因素相關，還需要我們進一步深入研究，以加深藥物對血管新生調控作用的認識。

［1］CARMELIET P.Angiogenesis in life，disease and medicine［J］. Nature，2005，438（7070）：932-936．

［2］施偉麗，張靜思，胡雅瓊，等.血府逐瘀湯防治血管相關性疾病臨床應用及作用機制研究進展［J］.中國中西醫結合雜志，2013，33（5）：712-716.

［3］翁德新.血府逐瘀湯聯合5-氟尿嘧啶治療小鼠移植性腫瘤的實驗研究［J］.現代中西醫結合雜志，2007，16（3）：311-312，356.

［4］蘇丹，姚麗.血府逐瘀湯的現代藥理學研究［J］.中醫藥學報，2013，41（3）：172-175.

［5］高冬，焦雨歡，武一曼，等.血府逐瘀湯誘導內皮祖細胞參與缺血區血管新生的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜志，2012，32（2）：224-228.

［6］高冬，陳文元，吳立婭，等.血府逐瘀湯誘導內皮細胞促血管新生的基因調控研究［J］.中國中西醫結合雜志，2010，30（2）：153-156.

［7］高冬，張靜思，胡雅瓊，等.非缺氧條件下血府逐瘀湯促內皮細胞血管形成中bFGF作用的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜志，2013，33（5）：623-626.

［8］李娜.缺氧預處理對人臍靜脈血管內皮細胞缺氧損傷保護作用的研究［D］.西寧：青海大學，2011.

［9］LIU S J，LI Y S，ZHOU X Y，et al.Protective effects and its mechanism of lipoxins on human umbilical vein endothelial cells under hypoxia［J］.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2009，44（4）：281-284.

［10］HANG X，LI P，LI Z，et al.Transcription and splicing regulation in human umbilical vein endothelial cells under hypoxic stress conditions by exon array［J］.BMC Genomics，2009，25（10）：126.

［11］蔡海瑞，劉海意，喬福元，等.缺氧對臍靜脈內皮細胞損傷及可溶性血管內皮生長因子受體-1 mRNA表達的影響［J］.中國婦幼保健，2009，24（11）：1559-1561.

［12］石曉明，吳勝春，唐雷，等.缺氧對血管內皮細胞低氧誘導因子-1α表達及增殖能力的影響［J］.廣東醫學，2013，34（5）：661-664.

［13］張量.缺氧對HUVMECs生物學特性及VEGFR表達影響的體外實驗研究［D］.瀘州：瀘州醫學院，2012.

［14］戴國華，馬培澤，宋憲波，等.缺氧對大鼠心肌微血管內皮細胞血管新生能力的影響［J］.山東醫藥，2014，54（18）：10-13.

［15］YANG X，ZHU H，GE Y，et al.Melittin enhances radiosensitivity of hypoxic head and neck squamous cell carcinoma by suppressing HIF-1α［J］.Tumour Biol，2014，35（10）：10443-10448．

［16］GREENBERG D A，JIN K L.Vascular endothelial growth factors（VEGFs）and stroke［J］.Cell Mol Life Sci，2013，70（10）：1753-1761.

［17］DU X，OU X，SONG T，et al.Adenosine A2B receptor stimulates angiogenesis by inducing VEGF and eNOS in human microvascular endothelial cells［J］.Exp Biol Med，2015，240（11）：1472-1479.

R285.5

B

1000-338X（2017）03-0051-03

2017-03-06

國家自然科學基金資助項目（81173431）

蔡飛（1991—），男，2014級中西醫結合基礎專業碩士研究生。

高冬（1967—），女，教授，主要從事血管新生研究。E-mail：gd1026@yahoo.com