2014～2016年廣州市屠宰場分離沙門氏菌血清學(xué)鑒定和耐藥性分析

吳荔琴，劉佩怡，伍宏凱，方秋華，肖田安，梁祺琦，何瀅

(廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗所，廣州 510230)

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2014～2016年廣州市屠宰場分離沙門氏菌血清學(xué)鑒定和耐藥性分析

吳荔琴，劉佩怡，伍宏凱，方秋華，肖田安*，梁祺琦，何瀅

(廣東省獸藥飼料質(zhì)量檢驗所，廣州 510230)

2014～2016年從廣州市屠宰場分離沙門氏菌151株，鑒定出12種血清型，前3位優(yōu)勢血清型分別為德爾卑沙門氏菌、羅森氏沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌。采用微量肉湯稀釋法測定分離菌株對13種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示，沙門氏菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑、氨芐西林、大觀霉素的耐藥率都在60%以上，對奧格門丁、恩諾沙星、氧氟沙星、頭孢噻呋、多粘菌素E敏感(耐藥率≤16%)，多重耐藥率為79.20%。研究表明，沙門氏菌對部分藥物耐藥性較嚴(yán)重，亟需加強養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物的合理應(yīng)用以控制耐藥性的發(fā)展。

沙門氏菌；血清型；耐藥性；屠宰場

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌，對人和動物的危害極大。2015年國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《食品安全風(fēng)險解析》，指出沙門氏菌居我國食源性疾病致病菌首位。2006～2010年間我國報告的病因明確的細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)事件中，70%～80%由沙門氏菌導(dǎo)致。美國食源性疾病主動監(jiān)測網(wǎng)運用所建立的模型評估認(rèn)為，美國每年有140萬非傷寒沙門菌病例，導(dǎo)致16.8萬人次就診，1.5萬人次住院和400人死亡。同樣，在歐盟所有病因明確的食源性暴發(fā)事件中，由沙門氏菌引起的占比較高。該病原菌對人類健康影響風(fēng)險較高、造成的經(jīng)濟損失和社會負(fù)擔(dān)較大。沙門氏菌在人和動物中具有廣泛的宿主，很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑進行傳播。豬是沙門氏菌病原體的主要儲存宿主，在屠宰的時候，豬胴體可能會被腸道中的沙門氏菌污染，從而引起人沙門氏菌感染，對公共衛(wèi)生構(gòu)成潛在威脅。隨著中國養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展和飼養(yǎng)的高度集約化，沙門氏菌已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病；抗生素的不合理使用導(dǎo)致沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性，耐藥范圍逐漸擴大，耐藥程度也在逐漸增加[1-2]。因此,應(yīng)實時監(jiān)測畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌耐藥趨勢的變化。本文擬調(diào)查2014～2016年廣州市生豬屠宰場分離沙門氏菌的血清型及其耐藥情況，以期為有效控制沙門氏菌的感染提供科學(xué)依據(jù)，保障公共衛(wèi)生安全。

1 材 料

1.1 樣品來源 2014～2016年從廣州市生豬屠宰場進行每年一次的樣品采集，樣品為豬盲腸拭子，并分離、鑒定沙門氏菌。

1.2 培養(yǎng)基和藥品 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司；Amies運送培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、SC增菌液和TTB增菌液，均購自青島海博公司；沙門氏菌核酸檢測試劑盒，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司；藥敏檢測板，天津金章科技發(fā)展有限公司；沙門氏菌診斷血清，泰國S&A公司。

1.3 儀器設(shè)備 離心機，德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀，美國BIO-RAD公司；水浴鍋，華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；滅菌器，日本Hirayama公司；渦旋振蕩器，德國IKA公司。

1.4 質(zhì)控菌株 鼠傷寒沙門氏菌CVCC 541，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

2 方 法

2.1 菌株分離 對健康豬屠宰后的盲腸，剪一小口，將無菌拭子插入，粘取盲腸內(nèi)容物，裝入Amies運送培養(yǎng)基，8 h內(nèi)分別接種到SC增菌液和TTB增菌液中，分別在36 ℃培養(yǎng)18～24 h和在42 ℃培養(yǎng)22～24 h，用接種環(huán)取增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，將可疑菌落接種另一個沙門氏菌顯色培養(yǎng)基進行純化，將純化的菌落接種于營養(yǎng)瓊脂做進一步鑒定。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 DNA模板的制備 取1 mL無菌水加入2 mL離心管中，用10 μL接種環(huán)將可疑沙門氏菌適量挑入離心管中，渦旋震蕩，12000 r/min離心5 min，去除上清液，加入0.5 mL無菌水，渦旋震蕩，沸水浴10 min，冰浴10 min，離心5 min，取上清液作模板。同時陰性菌株和沙門陽性菌株均參與提取，并作為PCR檢測試劑的質(zhì)控。

2.2.2 PCR-熒光探針法測定 取適量PCR反應(yīng)管，按照沙門氏菌核酸檢測試劑盒說明書進行操作。

2.3 血清型鑒定 確定的沙門菌屬，用沙門氏菌診斷血清進行分型。按照GB 4789.4-2010操作方法進行。

2.4 藥敏試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)，用微量肉湯稀釋法測定沙門氏菌的藥物敏感性，結(jié)果判定參照CLSI文件標(biāo)準(zhǔn)。操作參照藥敏檢測板說明書；對供試菌的最小抑菌濃度(MIC)進行判斷和數(shù)據(jù)讀取。測定藥物共9類13種，包括：氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素、大觀霉素、頭孢噻呋、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、氨芐西林、氟苯尼考、奧格門丁、多粘菌素E。同時做質(zhì)控樣品，質(zhì)控菌株為鼠傷寒沙門氏菌CVCC 541。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌落特征 沙門氏菌在顯色培養(yǎng)基上形成淡紫色的圓形菌落。

3.2 PCR鑒定 根據(jù)沙門氏菌核酸檢測試劑盒說明書判定，在陰性質(zhì)控的擴增曲線無明顯對數(shù)增長期或Ct值空白，陽性質(zhì)控的擴增曲線有明顯對數(shù)增長期或Ct值≤32的前提下，若樣品的擴增曲線有明顯對數(shù)增長期或Ct值≤36，則判樣品為沙門氏菌。共分離沙門氏菌151株，其中2014年65株，2015年49株，2016年37株。

3.3 血清型 分離的151株沙門氏菌除12株不能分型以外，剩下的139株共鑒定出12種血清型。占主導(dǎo)的前5種血清型分別是：德爾卑沙門氏菌(49株，32.45%)、羅森氏沙門氏菌(29株，19.21%)、鼠傷寒沙門氏菌(28株，18.54%)、倫敦沙門氏菌(11株，7.28%)、斯坦利沙門氏菌(9株，5.96%)。每年鑒定出的主導(dǎo)血清型基本一致；但所占比例存在變化，少見或罕見血清型差異較大。2014～2016年沙門氏菌的血清型分布見表1。

表1 2014～2016年沙門氏菌的血清型分布Tab 1 Serotype distribution among Salmonella, 2014～2016

3.4 藥敏結(jié)果 對151株沙門氏菌進行了9類13種抗菌藥物的敏感性試驗。從總體上來看，沙門氏菌對四環(huán)素(80.13%)、多西環(huán)素(77.48%)、磺胺異惡唑(71.52%)、氨芐西林(62.25%)、大觀霉素(60.93%)的耐藥率都在60%以上；其次是復(fù)方新諾明(48.34%)、氟苯尼考(37.75%)、慶大霉素(35.10%)的耐藥率在40%左右；對奧格門丁(15.23%)、恩諾沙星(14.57%)、氧氟沙星(9.93%)較低；個別菌株對頭孢噻呋(0.66%)耐藥，無菌株對多粘菌素E耐藥。連續(xù)3年耐藥率下降的藥物有氧氟沙星，連續(xù)3年耐藥率上升的藥物有慶大霉素、氨芐西林、氟苯尼考。151株沙門氏菌對9類13種抗菌藥物的耐藥性結(jié)果見表2。

3.5 多重耐藥 151株沙門氏菌對9類藥物的多重耐藥率(耐藥重數(shù)≥3)為79.20%，且有逐年上升的趨勢；最高為7耐(3.97%)。其中，2014年以4耐(18.46%)和6耐(16.92%)為主，2015年以5耐(18.37%)和3耐(16.92%)為主，2016年以5耐(35.90%)和4耐(28.21%)為主。2014～2016年沙門氏菌多重耐藥結(jié)果見表3。

表2 2014～2016年沙門氏菌耐藥性情況Tab 2 Antimicrobial resistance among Salmonella, 2014～2016

表3 2014～2016年沙門氏菌多重耐藥情況Tab 3 Multidrug resistance among Salmonella, 2014～2016

4 討論與小結(jié)

本次研究分離到的菌株中占主導(dǎo)的前5種血清型分別是：德爾卑沙門氏菌(32.45%)、羅森氏沙門氏菌(19.21%)、鼠傷寒沙門氏菌(18.54%)、倫敦沙門氏菌(7.28%)、斯坦利沙門氏菌(5.96%)。該前3種優(yōu)勢血清型結(jié)果與岳秀英等[2]調(diào)查四川省豬源沙門氏菌的主導(dǎo)血清型基本一致，但所占比例存在差異。四川省以德爾卑沙門氏菌為主，所占比例為60.26%；其次是鼠傷寒沙門氏菌(16.56%)和羅森氏沙門氏菌(6.6%)。黃照清[3]等在調(diào)查肉品中沙門氏菌血清型時，發(fā)現(xiàn)占主導(dǎo)是德爾卑沙門氏菌，比例高達(dá)82%。加春生[4]等對哈爾濱地區(qū)健康豬場直腸采樣分離沙門氏菌，經(jīng)鑒定以豬霍亂沙門氏菌(71.4%)為主，其次是豬傷寒沙門氏菌(22.9%)和鼠傷寒沙門氏菌(5.7%)。黃裕[5]等在調(diào)查深圳市畜禽產(chǎn)品中沙門氏菌血清型時發(fā)現(xiàn)，豬肉中的優(yōu)勢血清是倫敦沙門氏菌(19.51%)和德爾卑沙門氏菌(14.63%)。說明不同地區(qū)占主導(dǎo)的豬源沙門氏菌血清型有所交叉，也存在差異。根據(jù)張霆[6]等調(diào)查東莞地區(qū)引起腹瀉最常見的血清型主要是鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和斯坦利沙門氏菌等。曾健君[7]等在調(diào)查惠州市腹瀉患者感染沙門氏菌血清型中發(fā)現(xiàn)，引起腹瀉常見的血清型為鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。本研究調(diào)查屠宰場流行的血清型如鼠傷寒沙門氏菌、斯坦利沙門氏菌等對公共衛(wèi)生安全存在潛在威脅。

本研究中發(fā)現(xiàn)沙門氏菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑、氨芐西林、大觀霉素的耐藥率都在60%以上，其次是復(fù)方新諾明、氟苯尼考、慶大霉素的耐藥率在40%左右，對奧格門丁、恩諾沙星、氧氟沙星的耐藥率較低，在9%～16%之間，個別菌株對頭孢噻呋(0.66%)耐藥，無菌株對多粘菌素E耐藥。與四川省豬源沙門氏菌[2]相比，本研究分離的沙門氏菌對多種藥物的耐藥水平顯著較低。黃福標(biāo)[8]等分離南寧市豬腸道中沙門氏菌，對氨芐西林(55.56%)、慶大霉素(20%)、氧氟沙星(6.67%)的耐藥率較低，但對復(fù)方新諾明(80%)的耐藥率較高。不同省份豬源沙門氏菌也呈現(xiàn)出了各自的耐藥特點[9]，與獸醫(yī)臨床用藥情況相關(guān)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，分離菌株對氧氟沙星的耐藥率逐年下降，這可能與農(nóng)業(yè)部2292號公告停止在食品動物中使用氧氟沙星存在相關(guān)性；且國家每年實施“氟喹諾酮類藥物殘留監(jiān)測”計劃，促使養(yǎng)殖場對該類藥物的使用更加規(guī)范。但在連續(xù)3年監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，對慶大霉素、氨芐西林、氟苯尼考等藥物的耐藥率一直在上升，耐藥水平的上升可能與這三種藥物在獸醫(yī)臨床使用廣泛密切相關(guān)。

在151株沙門氏菌中有106株菌對3類及3類以上的藥物存在耐藥性，多重耐藥率為79.20%；顯著低于四川省豬源沙門氏菌(94%)[2]；與廣西南寧市豬腸道中沙門氏菌多重耐藥率(80%)[8]一致。但多重耐藥率從2014年的74.62%上升到87.18%。

屠宰場是畜禽產(chǎn)品受沙門氏菌感染的一個重要場所，多重耐藥沙門氏菌可能通過食物鏈傳遞給人類導(dǎo)致抗生素治療的失敗，對公共衛(wèi)生的風(fēng)險不可忽視。鑒于本研究的結(jié)果，亟需加強養(yǎng)豬業(yè)抗菌藥物的合理使用，實時動態(tài)監(jiān)測，有效遏制沙門氏菌耐藥性發(fā)展，保障豬肉及豬肉制品的安全，進而保障消費者健康。

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(編輯：侯向輝)

Identification Serotype and Antimicrobial Resistance ofSalmonellafrom the Slaughter Houses in Guangzhou from 2014 to 2016

WU Li-qin，LIU Pei-yi，WU Hong-kai，F(xiàn)ANG Qiu-hua，XIAO Tian-an*，LIANG Qi-qi，HE Ying

(GuangdongInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuffsControl,Guangzhou510230,China)

XIAOTian-an，E-mail：xta@gdivdc.com

A total of 151Salmonellastrains were isolated from the slaughter houses in Guangzhou from 2014 to 2016, and 12 serotypes were identified. Among the strains,S.derby,S.rissenandS.typhimuriumwere top 3 serotypes. Antimicrobial susceptibility amongSalmonellaisolates against 13 antimicrobial drugs was performed using microdilution method. The results showed that percents of resistance among the strains were more than 60% for tetracycline, doxycycline, sulfurazole, ampicilin, and spectinomycin, The strains were sensitive to amoxycilin/elavulanic acid, enrofloxacin, ofloxacin, ceftiofur, and polymyxin E (resistance rates were lower than 16% for these drugs). The multidrug-resistance rate was 79.20%. The researches show thatSalmonellastrains were seriously resistant to some drugs. It is urgent that the domestic industry should reasonably use antimicrobials to control the development of antimicrobial resistance.

Salmonella；serotype；antimicrobial resistance；slaughter house

吳荔琴，獸醫(yī)師，從事細(xì)菌耐藥性和獸藥殘留檢測研究。

肖田安。E-mail：xta@gdivdc.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.04

2017-03-23

A

1002-1280 (2017) 07-0015-06

S852.61