高效液相色譜法測(cè)定卡巴匹林鈣可溶性粉中卡巴匹林鈣和游離水楊酸的含量

林仙軍，張航俊，羅成江，陳曉林，徐晶，許國(guó)強(qiáng)

(1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101；2.浙江省諸暨市畜牧獸醫(yī)局，浙江諸暨 311800)

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高效液相色譜法測(cè)定卡巴匹林鈣可溶性粉中卡巴匹林鈣和游離水楊酸的含量

林仙軍1，張航俊1，羅成江1，陳曉林1，徐晶2，許國(guó)強(qiáng)2

(1.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 311101；2.浙江省諸暨市畜牧獸醫(yī)局，浙江諸暨 311800)

建立了一種可同時(shí)測(cè)定卡巴匹林鈣可溶性粉中卡巴匹林鈣和游離水楊酸含量的高效液相色譜方法。采用Agilent Zorbax XDB C18色譜柱，流動(dòng)相為0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶30,V/V)，流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果表明卡巴匹林鈣和水楊酸在0.1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999；卡巴匹林鈣回收率為97.4%～101.1%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～1.3%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～0.5%；水楊酸回收率為96.9%～101.2%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～1.5%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～0.5%。方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可用于卡巴匹林鈣可溶性粉的質(zhì)量控制。

卡巴匹林鈣；水楊酸；可溶性粉；高效液相色譜

卡巴匹林鈣是乙酰水楊酸鈣與尿素的絡(luò)合物，在水中水解為乙酰水楊酸，從而發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抑制血小板聚集的作用[1]。卡巴匹林鈣正逐步推廣應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，用于豬、雞的發(fā)熱和緩解疼痛等[2]。其制劑卡巴匹林鈣可溶性粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2013年)[3]，采用紫外分光光度法測(cè)定卡巴匹林鈣的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，但專屬性較差；水楊酸檢查項(xiàng)供試品溶液配制不合理，結(jié)果不穩(wěn)定。目前卡巴匹林鈣或水楊酸的檢測(cè)方法有毛細(xì)管電泳法[4]、高效液相色譜法[5-6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]和超高效液相色譜法[8-9]。高效液相色譜法快速、準(zhǔn)確，應(yīng)用廣泛，高效液相色譜法測(cè)定卡巴匹林鈣可溶性粉中卡巴匹林鈣和游離水楊酸的含量的方法未見報(bào)道。因此，本研究利用建立的方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，積累數(shù)據(jù)，以期為完善卡巴匹林鈣可溶性粉的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配VWD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；AG-285電子天平(Mettler公司)；SL502N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 主要材料 乙腈、甲醇均為色譜純，默克公司；磷酸為優(yōu)級(jí)純，浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸為分析純；水為超純水。

1.3 對(duì)照品和供試品 卡巴匹林鈣對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)H0691503，含量99.2%；水楊酸對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100106-201104，含量99.9%；卡巴匹林鈣可溶性粉，浙江大飛龍動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為50%，批號(hào)為20160801,20160802,20160803；卡巴匹林鈣原料為齊魯晟華制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)502080780，含量為98.9%；乳糖為湖南爾康制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20160701。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取卡巴匹林鈣和水楊酸對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成約50 μg/mL的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果卡巴匹林鈣在228 nm和276 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，在228 nm波長(zhǎng)處吸收值較大；水楊酸在228 nm波長(zhǎng)處也有較大吸收。綜合考慮，選擇228 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相的選擇 考察了乙腈-水、乙腈-磷酸溶液和乙腈-乙酸溶液等作為流動(dòng)相。乙腈-水為流動(dòng)相，卡巴匹林鈣和水楊酸出峰較快，峰形差；乙腈-磷酸溶液較乙腈-乙酸溶液峰形較好。比較了乙腈與0.05%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.3%磷酸溶液作為流動(dòng)相，各流動(dòng)相保留時(shí)間一致，磷酸濃度越高峰形越好，而乙腈-0.3%磷酸溶液pH值為1.5，對(duì)色譜柱損害較大；比較了0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶25,V/V)、0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶30,V/V)和0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶35,V/V)作為流動(dòng)相，0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶30,V/V)為流動(dòng)相峰形對(duì)稱，保留時(shí)間比較合適，分離較好。因此，選擇0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶30,V/V)作為流動(dòng)相。

2.3 卡巴匹林鈣對(duì)照品溶液的制備 取卡巴匹林鈣對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相超聲溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含50 μg的溶液，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.4 水楊酸對(duì)照品溶液的制備 取水楊酸對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相超聲溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含25 μg的溶液，搖勻，作為水楊酸對(duì)照品溶液。

2.5 卡巴匹林鈣和水楊酸檢測(cè)用供試品溶液的制備 取卡巴匹林鈣可溶性粉適量，精密稱定，用流動(dòng)相超聲溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，搖勻，作為水楊酸測(cè)定供試品溶液；取5.00 mL置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為卡巴匹林鈣測(cè)定供試品溶液。

2.6 高效液相色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱：Agilent Zorbax XDB C18 5 μm，4.6×250 mm；檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為0.2%磷酸溶液-乙腈(70∶30,V/V)。卡巴匹林鈣和水楊酸混合對(duì)照品溶液、卡巴匹林鈣測(cè)定供試品溶液、水楊酸測(cè)定供試品溶液和輔料乳糖色譜圖見圖1～圖4。卡巴匹林鈣和水楊酸的分離度大于5.0，理論板數(shù)以卡巴匹林鈣計(jì)大于3000。

圖1 混合對(duì)照品溶液(1：卡巴匹林鈣；2：水楊酸)Fig.1 Mixture of two reference substances(1.carbasalate calcium;2.salicylic acid)

圖2 卡巴匹林鈣測(cè)定供試品溶液(1：卡巴匹林鈣)Fig.2 Carbasalate calcium determination solution (1.carbasalate calcium)

圖3 水楊酸測(cè)定供試品溶液(1：卡巴匹林鈣；2：水楊酸)Fig.3 Salicylic acid determination solution (1.carbasalate calcium;2.salicylic acid)

圖4 輔料(乳糖)Fig.4 Accessories(lactose)

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察 分別取卡巴匹林鈣和水楊酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相超聲溶解并稀釋制成每1 mL中含卡巴匹林鈣和水楊酸100 μg的溶液，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。分別取混合對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為0.1、0.5、2.5、5、10、50 μg/mL的溶液，與混合對(duì)照品溶液一起依照濃度由小到大的次序，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，卡巴匹林鈣和水楊酸在0.1～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，卡巴匹林鈣線性方程Y=41.277X+11.205，相關(guān)系數(shù)r=0.9994；水楊酸線性方程Y=45.012X+0.1689，相關(guān)系數(shù)r=1.0000。

2.8 精密度試驗(yàn) 取卡巴匹林鈣對(duì)照品溶液(50 μg/mL)，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%；取水楊酸對(duì)照品溶液(20 μg/mL)，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%。表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為20160801的卡巴匹林鈣可溶性粉供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得卡巴匹林鈣峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%，測(cè)得水楊酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%。表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.10 方法專屬性 取卡巴匹林鈣可溶性粉各0.1 g，分別加水、1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液各1 mL，放置1 h，依法測(cè)定。卡巴匹林鈣在水中較不穩(wěn)定，水楊酸的量從1%升高到2%；在鹽酸溶液中穩(wěn)定(數(shù)據(jù)見穩(wěn)定性試驗(yàn))；在氫氧化鈉溶液中不穩(wěn)定，99%以上已降解為水楊酸；在過氧化氫溶液中不穩(wěn)定，約有20%降解為水楊酸。相應(yīng)色譜圖見圖5～圖8。

圖5 水1 h(1：卡巴匹林鈣；2：水楊酸)Fig.5 water 1 h (1.carbasalate calcium;2.salicylic acid)

圖6 1 mol/L鹽酸溶液1 h(1：卡巴匹林鈣；2：水楊酸)Fig.6 1 mol/L hydrochloric acid solution 1 h (1.carbasalate calcium;2.salicylic acid)

圖7 1 mol/L氫氧化鈉溶液1 h(2：水楊酸)Fig.7 1 mol/L sodium hydroxide solution 1 h (1.carbasalate calcium;2.salicylic acid)

圖8 5%過氧化氫溶液1 h(1：卡巴匹林鈣；2：水楊酸)Fig.8 5% hydrogen peroxide solution 1 h (1.carbasalate calcium;2.salicylic acid)

2.11 卡巴匹林鈣加樣回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為20160701的乳糖作為輔料，加入卡巴匹林鈣原料配制成40%、50%和60%的卡巴匹林鈣可溶性粉試樣，依法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)濃度連續(xù)3 d，每次做5份平行樣，計(jì)算回收率、批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，回收率為97.4%～101.1%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～1.3%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～0.5%，結(jié)果見表1。

2.12 水楊酸加樣回收率試驗(yàn) 由于水楊酸的限度為不得過1.5%，因此，取批號(hào)為20160701的乳糖作為輔料，加入水楊酸對(duì)照品適量，使成濃度約為0.5%、1.0%和1.5%的供試品，依法進(jìn)行測(cè)定。每

個(gè)濃度連續(xù)3 d，每次做5份平行樣，計(jì)算回收率、批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。回收率結(jié)果為96.9%～101.2%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～1.5%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～0.5%，結(jié)果見表2。

2.13 實(shí)際樣品測(cè)定 按照建立的檢測(cè)方法，對(duì)浙江大飛龍動(dòng)物保健品有限公司提供的卡巴匹林鈣可溶性粉進(jìn)行檢測(cè)，規(guī)格為50%，批號(hào)為20160801、20160802和20160803。卡巴匹林鈣的含量與紫外分光光度法一致；水楊酸的含量測(cè)定雖已考慮到在水中會(huì)降解的因素，加水溶解后立即測(cè)定，但結(jié)果還是較本法偏高。數(shù)據(jù)見表3和表4。

表1 卡巴匹林鈣加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab 1 Carbasalate calcium results of recovery test(n=5)

表2 水楊酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab 2 Salicylic acid results of recovery test(n=5)

表3 HPLC法與紫外分光光度法測(cè)定卡巴匹林鈣含量結(jié)果比較(n=3)Tab 3 Comparison of HPLC and UV spectrophotometry for the determination of carbasalate calcium(n=3)

3 小 結(jié)

游離水楊酸是卡巴匹林鈣的降解產(chǎn)物，需要嚴(yán)格控制。《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2013年)規(guī)定卡巴匹林鈣可溶性粉含水楊酸不得超過1.5%，采用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè)，供試品加水溶解后卡巴匹林鈣即開始快速水解為水楊酸，結(jié)果偏大且不穩(wěn)定，供試品溶液配制后放置1 h檢測(cè)結(jié)果即可增加一倍，差異顯著。合格的卡巴匹林鈣可溶性粉水楊酸檢查項(xiàng)目易誤判為不合格，給生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和檢驗(yàn)等帶來影響。

表4 HPLC法與紫外分光光度法測(cè)定水楊酸含量結(jié)果比較(n=3)Tab 4 Comparison of HPLC and UV spectrophotometry for the determination of salicylic acid(n=3)

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(編輯：侯向輝)

Determination of Carbasalate Calcium and Free Salicylic Acid in Carbasalate Calcium Soluble Powder by HPLC

LIN Xian-jun1, ZHANG Hang-jun1,LUO Cheng-jiang1,CHEN Xiao-lin1,XU Jing2，XU Guo-qiang2

(1.ZhejiangProvinceSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeed,Hangzhou,Zhejiang311101,China; 2.AnimalHusbandryandVeterinaryBureauofZhujiCountyinZhejiang,Zhuji311800,China)

A high performance liquid chromatography method was established for the determination of carbasalate calcium and free salicylic acid in carbasalate calcium soluble powder. Separation was performed on a reversed-phase Agilent Zorbax XDB C18 column. The mobile phase consisted of a mixture of 0.2% phosphoric acid solution and acetonitrile(70∶30,V/V) . The detection wavelength was 228 nm, the flow rate was 1.0 mL/min, and the column temperature was 30 ℃. A good linearity of the calibration curves was obtained with the range of 0.1～100 μg/mL for carbasalate calcium and free salicylic acid, the correlation coefficientr>0.999. The recoveries of carbasalate calcium were 97.4%～101.1%, the intra-assay coefficient of variation were 0.4%～1.3%, and the inter-assay coefficients of variation were 0.2%～0.5%. The recoveries of free salicylic acid were 96.9%～101.2%, the intra-assay coefficient of variation were 0.5%～1.5%, and the inter-assay coefficients of variation were 0.2%～0.5%. The method is simple, accurate and reliable in the determination of carbasalate calcium and free salicylic acid in carbasalate calcium soluble powder.

carbasalate calcium；salicylic acid；soluble powder；HPLC

林仙軍，高級(jí)畜牧師，從事獸藥、飼料和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)研究。E-mail: lxj1000@163.com

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.7.06

2017-01-03

A

1002-1280 (2017) 07-0028-06

S859.2