乳酸菌凍干工藝的設計

李玲　趙耀　曹珂珂

摘 要：目的：以乳酸菌為研究對象，研究設計其凍干工藝。方法：采用響應面法優化篩選出真空冷凍干燥的保護劑配方。結果：單因素實驗結果表明脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖3種保護劑保護效果較好，以細胞存活率為響應值，篩選出最佳復合保護劑為脫脂乳9.51%，麥芽糊精7.77%，葡萄糖7.56%。結論：通過試驗測得凍干后的存活率可達到90.08%，與預測值90.8303%接近。

關鍵詞：乳酸菌；真空冷凍干燥；保護劑；存活率

中圖分類號 Q935 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）14-0043-03

Abstract：Objective：The research aimed to study the freeze-drying process of lactic acid bacteria. Method：The response surface method was used to optimize the protective agent for vacuum freeze - drying.Result：The results of single factor experiments showed that the protective effect of defatted milk， maltodextrin and glucose was better， and the best survival rate was 9.51%，maltodextrin was 7.77%，7.56% glucose.Conclusion：The survival rate of the freeze-dried method was 90.08%， which was close to the predicted value of 90.8303%.

Key words：Lactic Acid Bacteria；Freeze-drying；Protectant；Survival rate

近年來，由于微生物學的迅速發展，乳酸菌得到了廣泛的研究和開發，它對機體多方面的保健功能逐漸得到了人們的重視[1]。目前，乳酸菌在乳制品的生產中已經得到了廣泛的應用，它可作為發酵劑用于酸奶、大豆酸奶、乳飲料等乳制品的生產。乳酸菌凍干粉的制備通常采用真空冷凍干燥技術，而在冷凍干燥過程中，對菌體的損傷是不可避免的，所以添加適宜的保護劑提高菌種的存活率對乳制品工藝生產具有十分重要的意義[2]。為此，本研究選取5種保護效果較好的凍干保護劑作為實驗對象，通過單因素實驗選擇3種效果較好的凍干保護劑，然后采用 Design-Expert8.0.6軟件的中響應面試驗建立數學模型確定最佳凍干保護劑配方[3-6]。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 菌種 乳球菌屬（Lactococcus）C1菌株，由同組實驗同學從酸奶、泡菜中分離而得，并保存在實驗室冰箱供使用。

1.1.2 培養基 MRS液體培養基（用于菌種的傳代、擴培和種子液制備）、MRS固體培養基（用于菌落計數），均由上海星科生物科技有限公司生產。

1.1.3 主要藥品 葡萄糖、谷氨酸鈉、維生素C、麥芽糊精、脫脂乳。

1.1.4 主要儀器與設備 BHC-1300IIA/B2-生物潔凈安全柜、DY04-12-44-00-立式壓力蒸汽滅菌器筒、YPB1003-電子天平、JW-3021H-High Speed Centrifuge、CVC FD8-5-冷凍干燥機、BC-50S-冰箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 菌種活化→制備菌液→離心收集菌體（稱重）→加入保護劑溶液→計活菌數（cfu/mL）→分裝→冰箱預凍（24h）→真空冷凍干燥→復水→計活菌數（cfu/mL）→計算存活率[7]。

1.2.2 菌種活化 取出冰箱里面冷藏的乳酸球菌，以3%的接種量接到100mLMRS液體培養基（滅菌）做第一次活化，經37℃恒溫培養24h后，吸取300μL涂平板檢測菌種的純度并記錄下活菌數，然后進行第二次活化。

1.2.3 活菌測定 以MRS固體培養基為計數培養基，采用梯度稀釋平板法計數[8]測活菌數。

1.2.4 菌體制備 通過查閱大量文獻確定最佳離心條件（4℃，6000r/min，15min）[9]。取8個50mL的無菌離心管，等量移入40mL菌液，在最佳離心條件下進行平衡離心。離心完畢后，取沉淀，用與上述菌液等體積的無菌生理鹽水（用于洗滌菌體）溶解沉淀菌體，進行第二次離心，最終得到乳酸菌泥。

1.2.5 真空冷凍干燥 將平皿先放入4℃冰箱平衡30min，然后放置-40℃冰箱中進行預冷凍20h。冷凍完成后放入真空冷凍干燥機中，設置溫度-50℃，抽真空（20～40Pa），干燥24h。

1.2.6 存活率的測定 將充分干燥成粉末的菌體取出后自然解凍，加入13.3mL滅菌的生理鹽水復水30min，用微量移液器吸取與凍干前等量的1mL菌液進行稀釋涂板計數。測定凍干前后的活菌數目，得出3組平行實驗的平均值，最終計算求得保護劑的冷凍存活率[10]。計算公式為：存活率（%）=復水凍干后的活菌數/樣品凍干后的活菌數×100

1.2.7 試驗設計 通過單因素試驗確定3種對乳酸菌保護效果較好的保護劑，然后采用Box-Behnken實驗設計，進行響應面實驗，最終確定最佳復合保護劑，并進行結果驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素保護劑的結果與分析 根據保護劑對菌體冷凍干燥的保護機理，結合有關文獻報道[11-13]，選取脫脂乳、麥芽糊精、葡萄糖、維生素C、谷氨酸鈉作為單因素保護劑，以存活率為目標，研究它們對乳酸菌的凍干保護效果，通過單因素實驗，選取最優的保護劑濃度列表，結果如表1所示。單因素實驗結果顯示，脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖這3種保護劑對菌體保護效果較好，其中脫脂乳作為保護劑的影響最顯著，其次是麥芽糊精與葡萄糖，其他保護劑保護效果并不是很理想。因此選取脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖為優化因子，然后根據結果確定它們各自的添加量，進行復合保護劑的優化。

2.2 Box-Behnken實驗設計結果與響應面分析

2.2.1 響應面實驗因子與水平 根據單因素實驗結果，進行三因素三水平響應面實驗，表2為試驗因素與水平編碼表。

2.2.2 響應面實驗設計與結果 詳見表3。

2.2.3 回歸模型與方差分析 對表3的實驗結果進行回歸分析，編碼值A、B、C分別代表葡萄糖、脫脂乳和麥芽糊精，方差分析數據如表4所示。

2.00AB-2.70AC+1.82BC-1.38A2-3.71B2-4.86C2。

由表4可知，回歸方程失擬項顯示不顯著（P=0.0881）且大于0.05，無失擬數據存在，實驗與模型擬合效果較好，說明此次的實驗值與預測值誤差小。模型中F=28.12、P<0.0001、R2=0.9731、R2adj=0.9385，表明模型是較顯著的，有很好的實驗意義。從表4可知，只有C2的P值小于0.001，表示C2影響最為顯著，A2、B2的P值均小于0.05說明A2、B2對存活率也有顯著影響。一次項B的P值=0.001小于0.05，而A、C項的P值均大于0.05，所以葡萄糖和麥芽糊精對存活率沒有顯著影響。交互項的P值均小于0.05，所以葡萄糖與脫脂乳、葡萄糖與麥芽糊精、脫脂乳與麥芽糊精對響應值的交互影響都顯[14]。

2.2.4 響應曲面圖及等高線圖的分析 圖1～3為Design-Expert8.0.6軟件設計得出等高線圖和其對應的3D圖，從圖中能夠直觀地看出葡萄糖、脫脂乳、麥芽糊精對存活率的影響程度和它們兩兩之間的交互作用。在等高線圖中，橢圓型或馬鞍型的高線表示顯著，而圓型的等高線表示較不顯著[15]。

由圖1可見，等高線呈橢圓形，表明葡萄糖和脫脂乳交互影響顯著。當麥芽糊精濃度為7.5%時，脫脂乳濃度范圍在7.5%～9.51%，葡萄糖濃度范圍在6%～7.56%時，凍干粉的存活率一直在增長，達到峰值后，增長趨勢越來越緩慢。當脫脂乳濃度為9.51%時，葡萄糖濃度為7.56%時，響應值達到最高點。

由圖2可見，等高線也呈橢圓形，說明麥芽糊精與葡萄糖交互作用也顯著，當脫脂乳濃度為11.5%時，麥芽糊精濃度范圍5.5%～7.77%，葡萄糖濃度范圍在6%～7.56%時，凍干粉的存活率一直在增長，達到峰值后，增長趨勢越來越緩慢。當麥芽糊精濃度為7.77%時，葡萄糖濃度為7.56%時，此時的存活率達到最大。

由圖3顯示，等高線呈橢圓形并不明顯，說明脫脂乳與麥芽糊精交互作用相比上述因素之間較不顯著，當葡萄糖濃度為9%時，脫脂乳濃度范圍在7.5%～9.51%時，麥芽糊精濃度范圍在5.5%～7.77%，響應值一直在提高，達到峰值后，增長趨勢越來越緩慢。當麥芽糊精濃度為7.77%時，葡萄糖濃度為7.56%時，此時的存活率達到最大。

2.3 驗證實驗 通過Design-Expert8.0.6軟件計算得到，當葡萄糖濃度為7.56%、脫脂乳濃度為9.51%、麥芽糊精濃度為7.77%時，存活率達到預測最大值為90.8303% 在此條件下平行實驗3次，求得平均值為90.08%，相對誤差為0.83%，實測值與預測值有稍許差異，表明響應面法得到的數學模型基本可靠。

3 結論

通過單因素實驗找出了脫脂乳、葡萄糖、麥芽糊精3個單因素作為優化因子，然后結合響應面法，找出存活率達到最高時的最佳復配保護劑為：當葡萄糖濃度為7.56%、脫脂乳濃度為9.51%、麥芽糊精濃度為7.77%，在此條件下預測值為90.8303%。通過驗證試驗，得出的存活率為90.08%。相對誤差值為0.83%，復配保護劑的存活率90.08%與不加保護劑時相比有非常明顯提高。

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（責編：張宏民）