平臥菊三七組織培養技術研究

沈春修　鄭子峰

摘 要：該研究以平臥菊三七的葉片為外植體，對影響其愈傷組織誘導及芽分化的相關因素進行了探討。結果表明，適合平臥菊三七愈傷組織誘導的最佳培養基為MS+2，4-D 1mg/L；愈傷組織分化出芽的培養基配方為MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.4mg/L。在1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L的培養基配方上生根較好，移栽到不同基質中的組培苗，存活率達100%。

關鍵詞：平臥菊三七；組織培養；外植體

中圖分類號 S565.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）14-0038-03

Abstract：Taking leaf blade of Gynura procumbens（Lour.）Merr as explants material，the factors that influence the callus induction and bud differentiation of Gynura procumbens（Lour.）Merr were studied.The results showed that the initial medium for the callus induction was MS+2，4-D 1 mg/L；the best medium for adventitious was MS+6-BA 1 mg/L+ NAA 0.4mg/L.The best subculture media for shoot proliferation was 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.3mg/L.Tissue culture seedlings were transplanted to a different matrix，the survival rate was 100%.

Key words：Gynura procumbens（Lour.）Merr；Tissue culture；Explant

平臥菊三七[Gynura procumbens（Lour.）Merr.]為菊科菊三七屬多年生宿根草本植物，是新開發出的一種藥食兼用的特種經濟作物，具有通經活絡，止痛消腫，消炎止咳，清熱解毒，活血生肌、抗病毒和增強人體免疫力等功效[1]。目前在江西宜春靖安縣有大規模種植，并且已建立平臥菊三七苗木繁育科技示范基地3個，面積約13.33hm2。平臥菊三七的繁殖方式主要是種子繁殖和扦插繁殖，而這2種傳統的繁殖方法易受到季節的影響，遠不能滿足市場上大規模的需求，急需找到一種快速繁殖種苗的新方法。植物組織培養是近幾十年來發展起來的一項無性繁殖技術，具有繁育周期短、種苗供應量大的特點，并且能很好的保證母本的優良品種特性。國內有部分研究者對平臥菊三七的組織培養技術進行了研究，如宋錫全等[2]以平臥菊三七的莖段為材料，利用誘導叢生不定芽培養基培育形成試管苗，同時還試驗了3種培養基對莖段帶菌液體培養生根生長的影響；石泰雷等[3]以平臥菊三七幼嫩莖段為材料，在已有分化培養基和生根培養基的基礎上，用市售普通白糖替代分析純蔗糖，并去除部分有機成分對平臥菊三七的快繁體系進行了優化；黃寶祥等[4]以平臥菊三七莖段為外植體，對其進行增殖培養、生根培養和栽培試驗，并取得一些結果。但以上這些研究都是以平臥菊三七莖段為材料，沒有獲得其愈傷組織，其繁殖率遠沒有達到預期的高效，同時，對平臥菊三七品種后期的改良也不能提供進一步的技術支持。

鑒于此，本研究將選取平臥菊三七葉片為初代培養的外植體，通過脫分化誘導愈傷組織，再分化形成芽苗，從而獲得平臥菊三七的組培苗，同時進一步加速平臥菊三七的擴繁周期，提高平臥菊三七繼代增殖培養速率與質量，優化平臥菊三七生根條件，為最終建立優質高效的平臥菊三七組培快繁技術體系提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 平臥菊三七采自江西宜春靖安縣（北緯28°46′～29°06′，東經114°55′～115°31′），栽植于宜春學院試驗基地，剪去當年生枝條上的新葉。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 外植體采集時間為晴天上午，取平臥菊三七生長期內健康無病蟲害、生長旺盛植株的當年生枝條上的新葉。先用洗潔精水漂洗5～15min，流水沖洗30min左右。后浸泡于無菌水中待用，于超凈工作臺上將外植體用75%的乙醇消毒處理15～20s，無菌水沖洗3～5次，然后用0.1%的升汞浸泡6～8min，再用無菌水沖洗多次，將葉片置于已滅菌的濾紙上吸干表面的水分后，用解剖刀切成面積大小為1cm2左右的小塊。

1.2.2 平臥菊三七叢生芽誘導培養 將生長狀況良好的愈傷組織切成小塊，接種到叢生芽誘導培養基上，培養基配方為MS培養基添加不同量的6-BA和NAA（見表1），培養約30d后統計叢生芽的出芽率及生長情況。

1.2.3 平臥菊三七組培苗生根培養和煉苗移栽 選取生長良好，長勢一致的分化苗接到生根培養基中，平臥菊三七生根培養基以1/2MS為基本培養基，添加不同濃度IBA，培養一段時間后統計其生根率。當組培苗生長到一定高度時，從光照培養箱中取出，打開瓶蓋，倒入少量無菌水，置于室內（避免陽光直射），一星期后，洗去根部培養基，晾干植株表面水分，栽植于不同基質中，45d后統計成活率及生長情況。

1.2.4 培養條件 誘導愈傷組織培養條件為暗培養，培養溫度為25～28℃；其余階段培養條件均為光照強度3000lx，光照時間12h，培養溫度為25～28℃。

2 結果與分析

2.1 平臥菊三七的愈傷組織誘導 平臥菊三七葉片組織塊接種到誘導培養基中，7d后觀察到葉片邊緣開始卷曲，并看到有黃色、顆粒狀愈傷組織產生，20d后統計其出愈率。結果見表1和圖1A。由表1可知，不同濃度的2，4-D均可誘導產生愈傷組織，當2，4-D濃度為1mg/L時，愈傷組織誘導率達到最高；繼續增加2，4-D的濃度，愈傷組織誘導率反而下降，且隨著培養時間的延長，這些愈傷組織較早出現老化現象。因此，適合平臥菊三七愈傷組織誘導培養基為MS+2，4-D1mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖。

2.2 平臥菊三七叢生芽誘導培養 生長狀況良好的平臥菊三七愈傷組織在分化培養基中培養30d后，觀察不定芽生長情況，結果見表2和圖1C和圖1D。由表2可知，影響平臥菊三七叢生芽生長的植物生長調節劑主要是細胞分裂素6-BA和生長素NAA的協同作用，在6-BA濃度一定的情況下，當NAA濃度從0.2mg/L增加到0.6mg/L時，平臥菊三七叢生芽的出芽率先增加后減少；但是當NAA濃度為0.4mg/L時，隨著6-BA的增加，平臥菊三七叢生芽的出芽率程大幅度變化，最高可達71.3%，最低甚至為0%，沒有出芽，說明對于平臥菊三七叢生芽的誘導，激素6-BA和NAA的濃度只要達到合適的范圍，才能保證出芽率最高。因此，最適合平臥菊三七愈傷組織分化出芽的培養基配方為MS+6-BA 1mg/L+NAA0.4mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖。當平臥菊三七叢生芽長到4～5cm高時，隨即移到增值壯苗培養基中繼續生長。20d后，苗會進一步長高長壯，就可以進行下一步的生根培養了。

2.3 平臥菊三七組培苗的生根培養和煉苗移栽 將平臥菊三七幼苗接入生根培養基中約10d左右開始生根，20d后隨機挑選3瓶統計平臥菊三七生根情況，結果見表3和圖1E及圖1F。由表3可知，IBA對平臥菊三七生根有一定的促進作用；當不加IBA時，根系生長緩慢；當IBA濃度從0.1mg/mL增加到0.5mg/mL時，根系生長數量增多，彼此差異變化幅度不大，綜合比較，平臥菊三七最適生根培養基為1/2MS+0.5mg/mL IBA+0.2mg/mL NAA。同時，將生長良好的幼苗經過適當煉苗后，移栽至不同基質中，45d后觀察平臥菊三七生長狀況，結果表明，平臥菊三七組培苗對土壤要求不是特別嚴格，在各種基質中都可以存活，存活率達100%。

3 結論與討論

植物離體快速繁殖體系的建立，需要離體的外植體材料在無菌的條件下完成脫分化和再分化，才能培養出組培苗。本研究中，選用葉片作為外植體，當培養基中2，4-D濃度小于1mg/L時，愈傷組織誘導率逐漸增加；當2，4-D濃度高于1mg/L時，愈傷組織誘導率反而下降，并且培養出的愈傷組織質地也較差，顏色較暗。說明2，4-D濃度過高或者過低不利于愈傷組織的誘導。這與一些學者的研究結果是一致的，盡管較高濃度的2，4-D有利于胚性愈傷組織的誘導，但一定程度上2，4-D也是促使愈傷組織褐化的一個因素[5-9]。故對于愈傷組織的誘導2，4-D使用的濃度不宜過大，從而減少培養過程中材料組織的無性系變異。本實驗中最適合的愈傷組織誘導培養基配方為MS+2，4-D1mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖。

在植物愈傷組織分化中，6-BA是一種重要的植物生長調節劑，單獨使用可以使愈傷組織得以分化[10]。但通常與其他植物生長調節劑配合使用，能起到更好的效果。本研究中，最適合平臥菊三七愈傷組織分化出芽的培養基配方為MS+6-BA1mg/L+NAA0.4mg/L+0.7%瓊脂+2%蔗糖，表明平臥菊三七愈傷組織分化出芽過程中，6-BA和NAA的濃度達到合適配比后，能使其出芽率大幅度提高。

綜上所述，本研究成功建立了一套完整的平臥菊三七快速繁殖體系，為其工廠化和規?；缣峁┝思夹g支持。

參考文獻

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