響應面法優化酶輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝研究

藍志福　陳建福

摘 要：為提高佛手瓜總黃酮提取率，采用酶輔助法對佛手瓜總黃酮的提取效果進行了研究。以總黃酮提取率為指標，研究了酶種類、酶用量、酶解溫度、pH和酶解時間對總黃酮提取率的影響，在此基礎上，利用響應面法對酶輔助提取佛手瓜總黃酮工藝條件進行了優化，建立了二次多項式模型，確定了最佳工藝條件。結果表明，在試驗的4種酶中，以纖維素酶為水解酶的提取效果最好。纖維素酶輔助提取佛手瓜總黃酮的最佳工藝條件為：酶用量1.0%，酶解溫度47℃，pH5.2，酶解時間46min，該條件下總黃酮提取率為3.802%，與預測值相比，相對誤差為0.653%，表明回歸模型所得數據與實驗結果符合良好，驗證了數學模型的有效性。該工藝與熱浸提法相比，總黃酮的提取率提高了25.9%，為佛手瓜總黃酮的深度開發與利用提供了科學依據。

關鍵詞：佛手瓜；總黃酮；酶輔助；響應面；優化

中圖分類號 TQ28；S38；TS255；Q814 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）14-0020-06

Abstract：In this work the enzymes-assisted technology was used for extraction total flavonoids from Sechium edule（Jacq.） Swartz. The effects of enzymes types，enzyme amount，enzymolysis temperature，pH and enzymolysis time on the yield of total flavonoids were studied. The response surface method had been used to further optimize the extraction process by an establishment of quadratic polynomial regression equation for optimal extraction condition. The results showed that the cellulase was the best enzyme with the highest total flavonoids extraction yield，Furthermore，the optimal extraction conditions of total flavonoids were as follows： enzyme amount 1.0%，enzymolysis temperature 47 ℃，pH 5.2，enzymolysis time 46 min. The yield of total flavonoids was 3.802% and the relative error between the theoretic values （3.827%） and testing values （3.802%） was 0.653%，which indicated the obtained data were in good agreement with the experimental results and the feasible model fitted well with the experimental data. Meanwhile the extraction yield increased by 25.9% compared with the traditional extraction method. Results could provide scientific foundation for the exploitation and utilization of the total flavonoids in Sechium edule（Jacq.） Swartz.

Key words：Sechium edule（Jacq.） Swartz；Total flavonoids；Enzyme-assisted；Response surface methodology；Optimization

佛手瓜（Sechium edule（Jacq.）Swartz）又名拳頭瓜、萬年瓜，為葫蘆科佛手瓜屬多年草本植物，佛手瓜味美可口、清脆多汁，是一種富含營養的珍稀蔬菜[1]。佛手瓜原產于西印度群島、墨西哥一帶，于20世紀初引入我國，由于其適應性強、高產質優、效益高，在我國的福建、廣東、廣西、云南等地區已廣泛栽種[2]。佛手瓜不僅含有豐富的鈣、鐵、鎂、鋅等微量元素，還含有胡蘿卜素、氨基酸、黃酮、多糖、果膠等天然功能性成分，是一種具有營養價值的藥食兩用保健蔬菜[3-4]。黃酮類化合物是植物花、葉、根中的多酚類物質，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂和預防心血管病等生理功能，可作為食品添加劑和功能性食品的原料，具有廣闊的應用前景[5-7]。已有文獻[8]報道了佛手瓜總黃酮的提取，文獻中使用的乙醇浸提法簡便易行，設備要求低，但提取效率較低。黃酮類物質主要存在于植物的細胞內，而細胞壁主要由纖維素構成，因此要使黃酮類物質從細胞內溶出到溶劑主體，必須先破壞植物的細胞壁或使細胞壁分解，才能有利于黃酮類物質的溶出[9]。本研究在文獻報道的基礎上，采用酶對佛手瓜進行酶解，以破壞其細胞壁，并對影響總黃酮提取率的因素進行了分析與優化，旨在為佛手瓜總黃酮的開發與利用提供理論依據。

1 試驗條件與方法

1.1 試劑與儀器 乙醇，分析純，汕頭西隴化工股份有限公司，使用時，配制成不同濃度（體積分數）的乙醇溶液；氫氧化鈉，分析純，天津市北辰方正試劑廠；佛手瓜，購于漳州西洋坪菜市場。蘆丁，標準品（UV≥98%），上海滬宇生物試劑公司；亞硝酸鈉，分析純，天津福晨化學試劑廠；硝酸鋁，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；中性蛋白酶，食品級5萬U/g，南寧東恒華道生物科技有限責任公司；纖維素酶，食品級5萬U/g，江蘇銳陽生物科技有限公司；α-淀粉酶，食品級5萬U/g，湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司；果膠酶，食品級5萬U/g，河南譽信誠生物科技有限公司。

采用上海美譜達儀器有限公司生產的UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計進行吸光度測試；采用北京四環科學儀器廠生產的LGJ10-C型冷凍干燥機進行冷凍干燥；采用上海冰都電器有限公司生產的Q-250B型高速多功能粉碎機對佛手瓜進行粉碎。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮標準曲線的繪制 利用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法[10]，以蘆丁為標準品，對總黃酮標準曲線進行繪制。將蘆丁標準品置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，準確稱取蘆丁10mg，用80%乙醇定容至100mL的容量瓶中，得到100mg/L蘆丁標準溶液。分別量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的蘆丁標準溶液于10mL的容量瓶中，分別加入0.3mL5%NaNO2溶液，搖勻，放置6min后加入0.3mL10%Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6min后再加4mL4%NaOH溶液，搖勻，放置20min后用80%乙醇定容，放置30min后分別測定其在510nm波長處的吸光度，以吸光度y為縱坐標，蘆丁濃度x為橫坐標，繪制標準曲線，將結果進行線性回歸，得方程為y=0.0102x-0.0013，相關系數R2=0.9999。

1.2.2 佛手瓜總黃酮的測定 取一定量的提取液于10mL的容量瓶中，按上述方法加相應的試劑，同時作空白。測定在510nm處的吸光度，代入吸光度與濃度的回歸方程，計算得到總黃酮濃度，用式（1）進行換算得總黃酮提取率。

佛手瓜總黃酮提取率（%）=[b×Vm×103×100] （1）

式中：m為佛手瓜的質量/g；b為回歸方程計算的總黃酮質量濃度/（mg·L-1）；V為提取液體積/L。

1.2.3 熱浸提取工藝 將佛手瓜洗凈切成條狀，并泡于蒸餾水中0.5h，撈起自然晾干后，冰凍，并于冷凍干燥機中進行干燥，粉碎，過80目篩備用。在裝有冷凝管的250mL三口燒瓶中，裝入一定量的佛手瓜粉末，按液料比20mL·g-1加入70%乙醇溶液，并于80℃恒溫浸取2h，過濾，濾渣再重復提取2次，結束后，合并濾液，濃縮，定容，按1.2.2中的方法計算得到總黃酮提取率。

1.2.4 佛手瓜總黃酮酶輔助提取 在250mL的燒杯中準確加入佛手瓜粉末5g，加入75mL蒸餾水，攪拌混合均勻，加入所需要的酶，按工藝設定酶解時間、pH、酶解溫度對佛手瓜粉末進行處理，處理完后，過濾并按1.2.3方法進行提取、計算得佛手瓜總黃酮提取率，并據上述方法，重復做3次平行實驗，得佛手瓜總黃酮提取率的平均值。

1.3 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，運用DesignExpert8.05b軟件，以總黃酮提取率為響應值，據Box-Behnken試驗設計原理，選取酶用量（A）、酶解溫度（B）、pH（C）、酶解時間（D）為考察因素，建立了四因素三水平的響應面實驗，實驗因素與水平編碼如表1所示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶種類對提取率的影響 選取不加酶（對照）、纖維素酶、α-淀粉酶、果膠酶和中性蛋白酶在液料比為15mL·g-1、酶用量1%（質量分數）、pH值和酶解溫度為各酶適宜范圍、酶解時間50min的條件下進行預處理，并按1.2.3進行佛手瓜總黃酮的提取，結果如圖1所示。由圖1中可以看出，加入酶后，佛手瓜中總黃酮的提取率增加。其中，纖維素酶使總黃酮的提取率增加最為顯著，果膠酶次之，α-淀粉酶和中性蛋白酶的作用較弱，總黃酮的提取率提高較不明顯。這是因為植物有效成分存在于由纖維素和果膠所構成的細胞壁內部，而纖維素酶和果膠酶能夠水解細胞壁中的纖維素和果膠來破壞細胞壁，使細胞內的黃酮類物質能夠充分釋放。果膠酶對佛手瓜總黃酮的提取效果低于纖維素酶，說明佛手瓜中細胞壁上的果膠含量比纖維素含量低[11]；α-淀粉酶和中性蛋白酶的作用不明顯，說明佛手瓜中淀粉和蛋白質的含量相對較少[12]。故選擇纖維素酶為提取所用酶。

2.1.2 酶用量對提取率的影響 固定酶解溫度50℃、pH5.0、酶解時間50min的條件下，考察了酶用量（0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%）對佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結果見圖2。

從圖2中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著酶用量的增加而增大，當酶用量為1.0%時，佛手瓜總黃酮的提取率達到最大，當酶用量超過1.0%后，總黃酮提取率又開始下降，這是因為隨著酶用量的增加，酶與佛手瓜顆粒細胞壁上的底物作用越來越多，加快了酶與底物的催化反應，促進了黃酮類物質的溶出而使得提取率提高，而當酶用量過大時，過多的酶包裹著底物，阻礙了酶促反應，從而導致了黃酮類物質溶出的困難[13]。故選擇酶用量為1.0%。

2.1.3 酶解溫度對提取率的影響 固定酶用量1.0%、pH5.0、酶解時間50min的條件下，考察了酶解溫度（40、45、50、55、60、65℃）對佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結果見圖3。從圖3中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著酶解溫度的增加而增大，佛手瓜總黃酮在酶解溫度為50℃時，提取率達到最大，繼續增大酶解溫度，提取率又逐漸下降，這是因為在較低溫度時，酶解反應較為緩慢，隨著酶解溫度的升高，酶的活性增強，酶解反應加快，總黃酮提取率增大，而當溫度過高時，酶會發生不可逆的變性而逐漸失活[14]，酶解能力下降，故選擇酶解溫度為50℃。

2.1.4 pH對提取率的影響 固定酶用量1.0%、酶解溫度50℃、酶解時間50min的條件下，考察pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結果見圖4。從圖4中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著pH的增加而增大，當佛手瓜總黃酮在pH為5.0時，提取率達到最大，繼續增大pH，總黃酮的提取率迅速下降。這是因為酶必須在適宜的pH范圍內才能存活，過高或過低的pH都將影響酶的解離，甚至會使酶失去活性，而纖維素酶活性的降低將直接影響到對植物細胞壁的作用[15]，纖維素酶在pH=5.0時呈現了最大的活力，故選擇pH為5.0。

2.1.5 酶解時間對提取率的影響 固定酶用量1.0%、酶解溫度50℃、pH5.0的條件下，考察了酶解時間（30、40、50、60、70、80min）對佛手瓜總黃酮提取率的影響，其結果見圖5。從圖5中可以看出，佛手瓜總黃酮提取率隨著酶解時間的增加而增大，當酶解時間在50min時，佛手瓜總黃酮提取率達到最大，超過50min后，提取率增加趨于緩慢。這是因為酶解時間較短時，酶與底物作用不充分，隨著酶解時間的增加，酶與底物的作用更加充分，細胞壁破壞增強，促使佛手瓜總黃酮更容易地溶出而使得提取率增大，而當酶解時間超過50min后，細胞壁上的纖維素已被酶解殆盡[16]，酶解時間繼續延長，已無法再大幅度增加提取率，故選擇酶解時間為50min。

2.2 佛手瓜總黃酮提取工藝的響應面優化

2.2.1 回歸模型及顯著性檢驗 在單因素實驗的基礎上，以酶用量（A）、酶解溫度（B）、pH（C）、酶解時間（D）為自變量，采用Box-Benhnken實驗設計，總黃酮提取率為響應值，利用DesignExpert8.05b軟件進行響應面分析，結果如表2和表3所示。

利用Design-Expert8.05b軟件對表2實驗結果進行多元回歸分析，得到響應值與各工藝因素間的二次多項回歸模型為：

Y=3.77+0.049A-0.1B+0.14C-0.057D+0.071AB-0.051AC+0.035AD-0.035BC+0.051BD+0.074CD-0.16A2-0.17B2-0.16C2-0.072D2，

從表3的方差分析可知，該回歸模型極顯著（P<0.0001），回歸方程的相關系數R2=0.9473，說明該模型的響應值有超過94%的數據可以用來對實驗數據進行解釋，方程的擬合度好、可靠性高；P值為0.0916>0.05，失擬項F值4.14，失擬項不顯著，說明該模型誤差小，回歸模型顯著，擬合度較好，說明在所考察的工藝條件范圍內可以用本模型來分析與預測。從P值及F值可以得到各工藝間的對總黃酮提取率的影響順序為：pH>酶解溫度>酶解時間>酶用量。二次項A2、B2、C2、D2，一次項B、C、D對試驗結果影響極顯著（P<0.01）；一次項A，交互項AB、CD對試驗結果影響顯著（P<0.05）；交互項AC、AD、BC、BD對試驗結果影響不顯著（P>0.05）。

2.2.2 響應面分析 根據響應面及等高線的形狀，可以分析酶用量、酶解溫度、pH和酶解時間對佛手瓜總黃酮提取率的影響并且可以得到最佳參數及各工藝因素之間的相互作用，根據回歸方程繪制出響應面及，如圖6所示，從圖6（A）中可知，酶用量和酶解溫度的交互作用顯著，酶用量較小時，酶解溫度對提取率的影響較大，隨著酶解溫度的增加總黃酮提取率迅速增大，而后總黃酮提取率又隨著酶解溫度的升高而降低；從圖6（B）中可知，酶用量和pH的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶用量的增大和pH的增加均呈現先增大后減小的趨勢；從圖6（C）中可知，酶用量和酶解時間的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶用量的增大呈現先增大后減小的趨勢，而總黃酮提取率隨著酶解時間的延長呈現先增大后又趨于穩定的趨勢；從圖6（D）中可知，酶解溫度和pH的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶解溫度的升高和pH的增加均呈現先增大后減小的趨勢；從圖6（E）中可知，酶解溫度和酶解時間的交互作用不顯著，總黃酮提取率隨酶解溫度的升高呈現先增大后減小的趨勢，總黃酮提取率隨著酶解時間的延長呈現先增大后又趨于穩定的趨勢。從圖6（F）中可知，pH和酶解時間的交互作用顯著，隨著pH的增大，總黃酮提取率先迅速增大，而后又迅速減小，隨著酶解時間的增加，總黃酮提取率逐漸增大后趨于穩定；由響應面和等高線圖以及分析可以看出，各工藝間的主次因素順序為pH>酶解溫度>酶解時間>酶用量。

2.2.3 最優條件的確定及驗證試驗 根據回歸模型分析，得到佛手瓜總黃酮的纖維素酶輔助提取的最佳工藝條件為：酶用量1.0%、酶解溫度47.90℃、pH5.21、酶解時間46.59min，該條件下總黃酮提取率的最大理論值為3.827%。為檢測回歸方程的可靠性，并考慮到實驗操作的便利性，將最優條件修正為：酶用量1.0%、酶解溫度47℃、pH5.2、酶解時間46min，并進行3次重復驗證實驗，得到佛手瓜總黃酮提取率為3.792%、3.806%、3.808%，平均值為3.802%，標準偏差為0.872%，與預測值相比，相對誤差為0.653%，表明回歸模型所得數據與實驗結果符合良好，驗證了數學模型的有效性。經過酶預處理后，與熱浸提法相比[8]，佛手瓜總黃酮的提取率提高了25.9%，為佛手瓜總黃酮的深度開發與利用提供了科學依據。

3 結論與討論

（1）植物有效成分主要存在于植物細胞內部，因此要使有效成分更多更快的溶出，必須破壞植物細胞壁。酶是專一而高效的催化劑，可以有效地破壞植物細胞壁上面的物質，從而增加細胞壁的通透性。通過實驗發現，纖維素酶的對細胞壁的破壞效果最好，提取率最高，果膠酶次之，這與植物細胞壁主要由纖維素和果膠所組成的相符，因此采用纖維素酶來水解細胞壁上的纖維素，可以最大程度地破壞細胞壁，降低有效成分通過細胞壁的阻力，使植物細胞內的有效成分更多更快地溶出，獲得最大的提取效果。

（2）以佛手瓜為原料，采用酶輔助法對佛手瓜總黃酮進行了提取，并在單因素實驗的基礎上，利用響應面法對纖維素酶輔助提取佛手瓜總黃酮的工藝進行了優化，建立了二次多項式回歸模型。實驗結果表明，在試驗的4種酶中，纖維素酶對佛手瓜總黃酮的提取效果最好，纖維素酶輔助提取佛手瓜總黃酮的最佳工藝參數為：酶用量1.0%、酶解溫度47℃、pH5.2、酶解時間46min，進行3次重復驗證實驗，得到佛手瓜總黃酮提取率的平均值3.802%，與預測值相比，相對誤差為0.653%，表明回歸模型所得數據與實驗結果符合良好，驗證了數學模型的有效性。經過酶預處理后，與熱浸提法相比，佛手瓜總黃酮的提取率提高了25.9%，為佛手瓜總黃酮的深度開發與利用提供了科學依據。

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（責編：張長青）