曲美他嗪通過抑制MicroRNA-423-5p凋亡信號通路保護H2O2引起的心肌缺血再灌注損傷

羅 鵬，張 維

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a．心血管內科，b．老年醫學科，四川 成都 610072)

曲美他嗪通過抑制MicroRNA-423-5p凋亡信號通路保護H2O2引起的心肌缺血再灌注損傷

羅 鵬a，張 維b

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a．心血管內科，b．老年醫學科，四川 成都 610072)

目的 探討曲美他嗪通過microRNA-423-5p(miR-423-5p)凋亡信號通路對H2O2引起的缺血再灌注損傷保護作用的分子生物學機制。方法培養小鼠心肌細胞，先以CCK-8和TUNEL檢測對比觀察H2O2對心肌細胞活性及凋亡的影響，同時以RT-q-PCR定量檢測各組心肌細胞內miR-423-5p表達的情況。再通過質粒轉染細胞上調和下調miR-423-5p的表達，觀察心肌細胞的活性及凋亡情況。最后在H2O2誘導組中加入不同濃度曲美他嗪，檢測miR-423-5p和下游通道的表達以及細胞活性和凋亡情況。結果以H2O2處理小鼠心肌細胞會上調miR-423-5p的表達，同時降低心肌細胞的活性并引起凋亡(p＜0.01)。以質粒轉染心肌細胞提高miR-423-5p表達可以降低心肌細胞活性并引發凋亡;降低miR-423-5p表達則可以減輕H2O2引起的細胞活性降低及凋亡效應(p＜0.01)。在H2O2處理組中加入曲美他嗪可以下調miR-423-5p的表達，同時減輕心肌細胞活性降低及凋亡比例(p＜0.01)。結論H2O2通過上調心肌細胞中的miR-423-5p表達誘導心肌細胞活性降低并引起凋亡，曲美他嗪通過抑制該miR的表達從而減少H2O2對心肌細胞活性的損傷并減少凋亡。

缺血再灌注損傷;microRNA-423-5p;H2O2;曲美他嗪

機體組織器官正常代謝有賴于良好的血液循環。各種原因造成的組織缺血，常常造成缺血性損傷。但在一定條件下恢復血液再灌注后，部分細胞功能代謝障礙及結構破壞不但未減輕反而加重，這種血液再灌注后缺血性損傷進一步加重的現象稱為缺血再灌注損傷。自由基對細胞的損害是造成缺血再灌注損傷的主要原因。H2O2是一種常見的氧自由基。H2O2在細胞內的積累與心肌缺血再灌注損傷有明確的關系［1］。MicroRNA(miR)是一類內生的、長度為20～24個核苷酸的小RNA，其在細胞內具有多種重要的調節作用。其調節方式主要是通過上調或下調表達量來完成的。本研究以不同濃度、時間強度的H2O2處理小鼠心肌細胞，觀察細胞活性和凋亡情況，同時測量細胞內miR-423-5p的表達水平。進而通過調節該miR的表達來模擬或保護此種細胞損傷。最后觀察曲美他嗪對于H2O2誘導的細胞損傷的保護作用與該miR的關系。以期揭示曲美他嗪對缺血再灌注損傷的保護作用的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料實驗用小鼠心肌細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫(上海)。曲美他嗪由施維雅公司(天津)提供。細胞培養所用試劑及RNA抽提、cDNA合成和q-PCR試劑盒均購買于ThermoFisherScientific公司(USA)。MicroRNA-423-5p、microRNA-423-5p-mimic質粒及 pMIR-REPORT載體購買AmbionLifeTechnologies公司(USA)。質粒擴增所用DH5α大腸桿菌菌株購買于Genewiz公司(美國)。細胞活性測定所用 CellCountingKit-8(CCK-8)檢測套件購買于BeyotimeInstituteofBiotechnology公司(美國)。細胞轉染用FuGENE?HD試劑盒均購買于Roche Diagnostics公司(USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理 所有的細胞培養都在37℃含5%CO2的濕潤空氣中以含10%胎牛血清的DMEM進行。細胞轉染依照FuGENE?HD轉染套件依照操作說明書完成。轉染操作時心肌細胞以2×105cell/孔的濃度種入6孔細胞培養板，培養24 h達到70%～80%融合度。其后，取2 μg質粒，以無血清的培養液，稀釋到 100 μl，再加入 5 μlFuGENE?HD轉染液，常溫反應15 min后加入6孔板后使用。H2O2處理時取70%～80%融合度的細胞，分別加入0、0.1、0.2、0.4 和 0.8 mM 的 H2O2，分別培養 12、24和48 h后行后續實驗。曲美他嗪處理時待細胞培養至70%～80%融合度，分別加入0、10、20、40和80 μM的曲美他嗪，培養心肌細胞24小時后行后續實驗。

1.2.2 載體構建 將miR-423-5p和miR-423-5pmimic質粒以DH5α大腸桿菌菌株擴增并提取，存于-20℃冰箱內備用。質粒濃度以ThermoND 2000分光光度計(ThermoFisherScientific，Inc．)測定。

1.2.3 細胞活性檢測 細胞活性以CCK-8測定套件測定，選定波長450 nm，每標本測定3次取平均值。

1.2.4 RT-q-PCR 依照操作手冊以TRIzol裂解液提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，然后進行RT-PCR操作。結果以Bio-RadCFX96 thermalcycler(Bio-Rad Laboratories，Inc．)檢測。

1.2.5 細胞凋亡檢測 使用DeadEndTMFluorometricTUNEL系統(Progega)，以操作說明書流程檢測心肌細胞中的凋亡細胞。TUNEL-陽性的細胞在DTX500熒光顯微鏡(Nikon)下可見細胞核有暗綠色熒光顯現，隨機選取5個視野取平均值進行相對計數。

1.2.6 MiR-423-5p 介導H2O2引起細胞活性降低及凋亡的檢驗構建并引入miR-423-5p和miR-423-5p-mimic兩種質粒(后者可以中和前者的活性)，并以miR-Control做空白對照進行檢驗。以RT-q-PCR檢驗以下各組心肌細胞活性，同時以TUNEL套件檢驗上述各組心肌細胞的凋亡情況:空白對照組、獨立H2O2(0.4 mM)處理組、H2O2(0.4 mM)聯合miRControl組、H2O2聯合miR-423-5p-mimic質粒組以及獨立miR-423-5p質粒組。

1.3 統計學方法使用SPSS 13.0統計學軟件包進行數據處理，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2降低心肌細胞活性并誘導miR-423-5p的表達以H2O2(0.4mM)處理12 h后心肌細胞活性明顯降低，繼續延長處理時間到24～48 h可以進一步降低心肌細胞活性;以H2O2(0.4 mM)處理12 h后心肌細胞中miR-423-5p的表達明顯上調，繼續延長處理時間到24～48 h后其表達會進一步上調(表1)。以0.1 mM濃度的H2O2處理心肌細胞24 h不會明顯降低其活性，但以0.2、0.4和0.8 mM濃度的H2O2處理則會明顯抑制心肌細胞的活性;同樣處理24小時，以0.2、0.4和0.8 mM濃度的H2O2處理后的心肌細胞中miR-423-5p的表達也是遞增的，而0.1 mM濃度的H2O2對該miR的表達影響不明顯(表2)。

表1 相同濃度H2O2(0.4 mM)不同時間長度處理心肌細胞后細胞活力及miR-423-5p的表達情況

表2 以不同濃度H2O2處理相同時間長度(24小時)處理心肌細胞后相對細胞活力對比

2.2 MiR-423-5p介導了H2O2誘導的心肌細胞活性降低和凋亡以miR-423-5p質粒處理心肌細胞，可以將細胞內miR-423-5p的表達水平提高到對照組的8.12±0.43倍(P＜0.01);而以 miR-423-5p-mimic質粒處理，則會將其降低至對照組的0.26±0.03倍(P＜0.01)。單獨以H2O2處理或單獨以miR-423-5p質粒轉染均可以明顯降低心肌細胞活性;H2O2聯合miR-423-5p-mimic質粒處理組對比對照組無明顯差異;以H2O2處理或以miR-423-5p質粒導致過表達均會明顯增加心肌細胞的凋亡;以H2O2處理再以miR-423-5p-mimic抑制其表達則可以明顯減少凋亡情況(表3，圖1)。

表3 以不同方式處理心肌細胞后相對細胞活力及miR-423-5p的表達情況

圖1 不同質粒轉染H2O2處理后心肌細胞TUNEL照片(熒光標識存活細胞)

2.3 曲美他嗪通過抑制miR-423-5p的表達減輕H2O2誘導的心肌細胞活性降低及凋亡以H2O2(0.4 mM)分別聯合 0、10、20、40 和 80 μM 的曲美他嗪(TMZ，下同)處理心肌細胞48小時后，以RT-q-PCR檢驗miR-423-5p的表達水平。與0 μM組比較，10、20 μM 曲美他嗪組 miR-423-5p表達明顯降低，但繼續提高濃度不能進一步降低該miR的表達(表4)。以TUNEL檢驗上述各組心肌細胞的凋亡情況，以曲美他嗪抑制miR-423-5p的表達可以明顯減少心肌細胞的凋亡情況(表4，圖2)。

表4 以不同方式處理心肌細胞48 h后miR-423-5p的表達情況及細胞凋亡指數

圖2 不同濃度曲美他嗪干預H2O2處理后心肌細胞的TUNEL照片(熒光標識存活細胞)

3 討論

已有的大量研究表明，心肌活性降低和凋亡在缺血性心臟病、心力衰竭、心律失常等多種心臟疾患中扮演著重要的角色。在心肌細胞缺血再灌注損傷中，細胞中產生并積累的H2O2等自由基導致線粒體功能障礙、DNA損傷等多種細胞損害，引起細胞活性降低及凋亡，并最終導致心力衰竭和心律失常等后果［4］。為減輕此種損傷，保護心臟功能，研究人員進行了大量的實驗。

基于自由基損傷機制，我們有理由相信，可以直接對抗自由基的抗氧化劑可以在一定程度上保護心肌細胞，減輕缺血再灌注損傷。已有研究證實包括維生素C的一些抗氧化劑可以減輕過氧化物誘導的缺血再灌注損傷情況，保護心臟的功能［5］。另研究顯示，曲美他嗪等心肌代謝治療藥物同樣可以減輕心肌缺血再灌注損傷，改善預后［6］。但此種保護的機制明顯不同于抗氧化劑，一直未被完全明確。

近年發現，miR表達的改變見于各種心臟疾病中，除提供了新的可能的檢驗指標外，還提供了可能的治療靶點。miR-423-5p是其中較為受到關注的一個。目前已發現，miR-423-5p在慢性心力衰竭患者的循環中表達明顯上調，并與預后有關［7］。曲美他嗪可以改善缺血所致心力衰竭的預后［8］。

本實驗發現，H2O2可以誘導心肌細胞上調miR-423-5p的表達，且此種誘導呈時間和濃度依賴。此種表達的上調會降低心肌細胞活性，并誘導其凋亡。以miR-423-5p-mimic沉默miR-423-5p的表達可以抑制心肌細胞活性的降低，并減少凋亡。既往已有實驗提示 miR-423-5p的直接下游靶點 OGT、p-AMPK和26 s蛋白酶體都與凋亡相關［3］。部分揭示了自由基誘導心肌細胞凋亡的信號通路。

實驗同時發現，曲美他嗪可以減少H2O2誘導的miR-423-5p表達上調，在一定程度上阻斷miR-423-5p、OGT、p-AMPK和26 s蛋白酶體信號通路。從而減輕H2O2誘導的心肌細胞活性降低和凋亡，保護受到缺血再灌注損傷心肌?？梢圆糠纸忉屢郧浪哼M行心肌代謝治療為何可以減輕缺血再灌注損傷并保護心臟功能。

H2O2可以誘導心肌細胞上調miR-423-5p的表達，且此種誘導呈時間和濃度依賴，下調或者沉默該miR可以減少H2O2誘導的心肌細胞凋亡，一定程度上減輕自由基導致的心肌缺血再灌注損傷。這個結果提示 miR-423-5p可能可以作為一個有效的治療靶點來減輕心肌缺血再灌注損傷。

［1］Khurana S，Hollingsworth A，Piche M，et al．Antiapoptotic actions of methyl gallate on neonatal rat cardiac myocytes exposed to H2O2［J］．Oxid Med Cell Longev，2014，2014:657512

［2］Luo P，He T，Jiang R，et al．MicroRNA-423-5p targets O-GlcNAc transferase to induce apoptosis in cardiomyocytes［J］．Mol Med Rep，2015，12(1):1163-1168．

［3］Soukoulis V，Boden WE，Smith SC Jr，et al．Non-antithrombotic medical options in acute coronary syndromes:old agents and new lines on the horizon［J］．Circ Res，2014，6，114(12):1944-1958．

［4］Peng YW，Buller CL，Charpie JR．Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury ［J］．Pediatr Res，2011，70(1):61-66．

［5］Kane AD，Herrera EA，Camm EJ，et al．Vitamin C prevents intrauterine programming of in vivo cardio-vascular dysfunction in the rat［J］．Circ J，2013，77(10):2604-2611．

［6］蔣劉霞，傅國勝，壽曄，等．曲美他嗪對PCI術相關心肌缺血再灌注損傷及預后的影響［J］．中國現代醫生，2014，52(19):4-7．

［7］Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al．MiR423?5p as a circulating biomarker for heart failure［J］．Circ Res，2010，2，106(6):1035-1039．

［8］劉南朝，周有華．曲美他嗪聯合瑞舒伐他汀對老年缺血性心肌病心力衰竭患者心功能及N-腦鈉肽前體的影響［J］．實用醫院臨床雜志，2015，12(3):124-126．

Trimetazidine targets microRNA-423-5p signal pathway to protect cardiomyocytes from H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries

LUO Penga，ZHANG Weib(a．Department of Cardiology，b．Geriatric Medicine，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，610072，China)

ZHANG Wei

Objective To investigate the molecular biological mechanism of the protective effect of trimetazidine against H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries．MethodsMouse cardiomyocytes were cultured．The effect of H2O2on cardiomyocytic activity and apoptosis was observed by detection of CCK-8 and TUNEL．Meanwhile，the expression of microRNA-423-5p(miR-423-5p)in myocardiocytes following exposure to H2O2was determined by using RT-q-PCR analysis．Further，up-or down-regulation of miR-423-5p were carried out through plasmid transfection to cells to observe the cardiomyocytic activity and apoptosis．Finally，expression of miR-423-5p and downstream as well as cardiomyocytic activity and apoptosis in the H2O2induce group after addition of various concentrations of trimetazidine．ResultsH2O2increased the expressions of miR-423-5p，decreased myocardiocytic activity and induced cell apoptosis(P ＜ 0.01)．The plasmid transfection to myocardiocytes increased the expression of microRNA-423-5p that decreased myocardiocytic activity and induced cell apoptosis．However，the decreased expressions of miR-423-5p could reduce the effect of H2O2(P ＜0.01)．Trimetazidine could decrease the expression of miR-423-5p and relieve the H2O2-induced decrease of myocardiocytic activity and apoptosis(P ＜ 0.01)．ConclusionH2O2induces the myocardial cell activity and apoptosis through up-regulating the expression of microRNA-423-5p．Trimetazidine targets microRNA-423-5p signal pathway to protect cardiomyocytes from H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries．

Ischemic reperfusion;MicroRNA-423-5p;H2O2;Trimetazidine

R541.4

A

1672-6170(2017)04-0026-04

2016-12-09;

2017-05-03)

張 維