表面等離激元結構光照明顯微成像技術研究進展?

張崇磊 辛自強 閔長俊袁小聰

(深圳大學,納米光子學研究中心,深圳 518060)

表面等離激元結構光照明顯微成像技術研究進展?

張崇磊 辛自強 閔長俊1)?袁小聰?

(深圳大學,納米光子學研究中心,深圳 518060)

(2017年3月29日收到;2017年4月27日收到修改稿)

結構光照明顯微成像技術(SIM)因其高分辨、寬場、快速成像的優勢,在生物醫學成像領域發揮了不可估量的作用.結構光照明顯微成像技術與動態可控的亞波長表面等離激元條紋相結合,可以在不借助非線性效應的情況下,將傳統SIM的分辨率從2倍于衍射極限頻率提升到3—4倍,此外還有抑制背景噪聲、提升信噪比的能力,在近表面的生物醫學成像應用中有重要價值.本文介紹了表面等離激元結構光照明顯微成像技術的原理,并總結了近幾年國內外的相關研究進展.

結構光照明,超分辨成像,表面等離激元

1 引 言

光學顯微成像技術的應用與發展極大地推動了人們對生命現象的研究與認知.然而,由于光學衍射極限的存在,傳統光學顯微成像技術的空間分辨率最高只能達到200—300 nm[1-3],無法滿足觀測生物細胞微結構等重大應用需求,也對能夠突破衍射極限的超分辨光學顯微成像技術提出了新的挑戰.為此,近些年大批新穎的超分辨光學顯微成像技術被陸續提出并快速發展,獲得了科學界的廣泛關注.2014年諾貝爾化學獎就頒給了“超分辨熒光顯微成像技術”,以表彰該領域科學家的突出貢獻.

提高光學成像分辨率的關鍵問題是如何獲取樣品的光學高頻信息,但是光學高頻信息主要局域在光學近場范圍,即樣品表面一到幾個波長范圍內,無法傳播到遠場自由空間被探測到.為了解決這個問題,人們發展出許多近場光學成像技術來提取光學高頻信息.例如：掃描近場光學顯微鏡(scanning near- field optical microscope,SNOM),該技術通過亞波長探針將只在物體表面傳播的倏逝波(evanescent wave)即高頻信息轉換成可以在遠場探測的傳播場,由此大幅提高了成像分辨率,分辨率可達20—50 nm[4-6];另外超透鏡(superlens)是基于納米金屬薄膜結構的一種新穎成像技術[7],可以通過特殊結構設計將倏逝波傳遞并放大到遠場,使人們可以觀測到物體表面的精細信息,從而突破了衍射極限[8-12].

因為近場光學顯微成像技術只能獲取樣品表面局部的近場信息,所以只適合于物體表面信息的探測.相比于近場光學成像方法,遠場光學成像方法則更加靈活,能在提高x-y平面橫向空間分辨率的同時,也具有z方向的縱向分辨率,從而得到樣品的三維光學信息.近些年,不少遠場超分辨光學成像方法得到了很大發展[13-23].為了克服光學衍射極限,這些遠場成像方法從另一個角度出發考慮：光學衍射極限理論是建立在線性光學的基礎上,線性的超分辨技術不可能真正突破它,但可以利用非線性效應來打破光學衍射極限.例如,受激發射損耗(STED)[13]顯微鏡利用熒光分子的非線性效應,用一束光作為激發光激發熒光,再用另一束長波長同軸的中空環形光束損耗掉部分第一束光激發的熒光,只剩下中間極小的熒光點,從而得到更銳利的點擴散函數.此技術成像分辨率可達30—80 nm范圍,并可實現三維光學成像,但也因為其逐點掃描的成像方式,往往需要消耗大量的時間成本.此外,還有隨機光學重建技術(STORM)[14]和光激活定位顯微技術(PALM)[15]都是單分子定位顯微技術,通過熒光分子的非線性效應(例如光活化、光開關等)控制小部分熒光分子進入激發態,然后成像在遠場電荷耦合器(CCD)中,最后通過高斯擬合得到這些發光分子的精確位置.這種方法可以讓相互影響的衍射光斑在不同時刻分別記錄,從而消除衍射影響.在每張原始圖片上雖然只有少數熒光斑點,但上千張圖片集合起來就組成了所有熒光分子的強度分布圖,猶如點彩(pointillism)圖畫一樣.其成像分辨率可達30 nm級別,但是這種方法局限在小范圍成像,且需要大量圖片集合,成像和處理過程復雜,時間分辨率低.同時STED和PALM/STORM通常所需要的輻射強度在103—108W/cm2,在這種情況下,熒光蛋白/分子很容易被漂白,產生大量的自由基,損傷活細胞樣品.

結構光照明顯微成像技術(structure illumination microscopy,SIM)是一種遠場超分辨光學顯微成像技術,其原理是在寬場熒光顯微鏡的基礎上,利用特殊調制的結構光場來照明樣品,并運用特定算法從調制圖像數據中提取焦平面的信息,從而突破衍射極限的限制,重建出超分辨切層的圖像信息.這種超分辨成像技術不需要逐點掃描樣品,可大范圍成像,具有快速、超分辨、寬場顯微成像的顯著優點.2000年,美國霍華休斯醫學研究院的Gustafsson等[16]首次在實驗上證實了SIM的可行性,使用SIM成像方法對Hela細胞的肌動蛋白細胞骨架進行了寬場超分辨成像研究,實現了170 nm左右的成像分辨率.2005年Gustafsson等[17]進一步利用非線性效應的飽和熒光成像技術對熒光顆粒實現了50 nm左右分辨率的超分辨成像.隨后Gustafsson等[18,19]又研究了對生物樣品的三維成像技術,實現了SIM寬場超分辨成像技術在生物醫學中的應用,成像分辨率在100 nm左右. 2008年,Schermelleh等[20]將SIM技術應用到哺乳動物亞細胞核結構的成像中,對多重染色下的染色質、核纖層和核孔進行了高分辨率的精確成像,開啟了細胞核物質運輸交換研究的大門 (圖1(a)).2007年起,Chung等[21],Folka等[22]和Gliko等[23]先后使用全內反射顯微鏡實現了表面倏逝場的SIM成像,由于表面倏逝場的穿透深度在100 nm左右,這些超分辨成像研究對于了解生物樣品膜表面特性具有重要的意義.2011年,Betzig課題組[24]報道了基于貝塞爾光束的結構光照明顯微成像,實現了細胞內囊泡、線粒體、有絲分裂的染色體等多種組分的動態3D成像(圖1(b)).2015年,Betzig課題組[25]報道了利用一種新型反復光激活熒光蛋白Skylan-NS和結構光激活的非線性SIM技術,獲得了細胞運動和改變形狀過程中骨架蛋白的解體和自身再組裝過程,以及在細胞膜表面的caveolae的微小內吞體動態過程的影像(圖1(c)).

圖1 不同SIM顯微成像技術效果圖[20,24,25]Fig.1.The imaging e ff ect of di ff erent SIM microscopy technologies[20,24,25].

表面等離激元結構光照明顯微成像(plasmonic structure illumination microscopy,PSIM)將SIM超分辨顯微成像技術與可動態調控的表面等離激元(surface plasmons,SPs)干涉條紋相結合,可以在不借助非線性效應的情況下,將傳統SIM的分辨率從2倍于衍射極限頻率提升到3—4倍.SPs干涉條紋是由兩個相向傳播的SPs波干涉產生的穩定駐波場,條紋周期大小依賴于SPs波長.由于SPs波長可遠小于自由空間光波長,所以SPs干涉條紋的周期也遠小于衍射極限,從而可作為一種突破衍射極限的結構光場應用于SIM成像系統.所以PSIM作為一種新型的超分辨寬場顯微成像技術,結合了SIM顯微技術和SPs特性的優勢,進一步提高了成像分辨率[26-32].2010年,美國加州大學圣地亞哥分校劉照偉教授等[26]首次明確提出類PSIM的概念,通過設計不同SPs激發結構,采用調整激發角的方式得到PSIM成像,其所在課題組隨后又開展了基于不同結構的PSIM成像驗證實驗[27-29].同年,袁小聰教授課題組[30]利用全光緊聚焦激發金屬膜SPs,并動態調控入射光學旋渦的拓撲荷實現多步相移,達到了接近理論值的PSIM成像分辨率,其課題組后期又在振幅調控、分數階拓撲荷等方面進行了改進[31,32].目前PSIM成像技術作為一種仍在發展中的超分辨成像技術,在成像分辨率、削弱背景噪聲等方面有明顯優勢,但其成像范圍局限于金屬表面,只能實現二維平面成像結果.目前已有利用PSIM成像技術實現超分辨增強拉曼光譜信號的研究報道[33],相信隨著PSIM成像技術的不斷研究發展,此技術的性能參數會得到進一步提升,并在生物醫學領域實現更多重要應用.

2 基本理論

在介紹PSIM技術原理之前,有必要先了解SPs的基本特性、激發方式以及傳統SIM的成像原理,以便對PSIM技術進行更深層次的研究.

2.1 表面等離激元的色散關系

表面等離激元是局域于金屬表面的一種電磁振蕩波,有的文獻中也稱為表面等離子體[34]. 20世紀初,Wood[35]檢測了具有連續光譜的偏振光經過光柵后的變化情況,發現偏振光的頻譜在某一區域內出現損失的現象,稱為“Wood異常”,這是對于SPs現象的最早記載.1941年,Fano[36]發現“Wood異常”現象是由于一種表面波引起的,并提出了體積等離激元的概念,初步解釋了SPs產生的原理.1957年,Ritchie[37]發現當電子穿過金屬膜之后存在能量消失峰的現象,他定義這種消失峰為“能量降低的”等離激元模式,并對這種模式與薄膜邊界之間的關系進行了分析,首次提出了“金屬等離激元”的概念,用于描述金屬內部電子密度的縱向波動情況.在1958年,Stem和Farrel[38]研究了此種模式產生的條件并首次提出了“表面等離激元共振(surface plasmon resonance,SPR)”的概念.隨后在1960年,Powell和Swan[39]通過實驗證實了Ritchie的理論.1998年,Ebbesen等[40]在《Nature》報道了SPs在亞波長金屬孔陣列結構中的異常透射增強現象之后,SPs因其具有亞波長尺度光信號傳遞與增強特性再次引起了廣大研究人員的興趣,有關SPs的新現象、新機理和新應用的研究不斷發展.2003年,Barnes等[34]在《Nature》上發表了題為“表面等離激元亞波長光學(surface plasmon subwavelength optics)”的綜述文章,標志著SPs光學的興起并逐漸形成一門獨立的學科.近年來隨著納米尺寸加工技術的進步,基于SPs的各種新奇應用不斷涌現,如突破衍射極限的成像[26]、亞波長波導[41]、等離激元刻蝕[42]、負折射率材料等[43].

(1)式為從麥克斯韋方程組推導出的金屬/介質分界面的表面等離激元色散公式[44].圖2所示為光在自由空間(A)、高折射率介質(B),以及表面等離激元(C)的色散關系曲線.由于金屬介電常數的實部為負值,根據(1)式SPs的波矢要大于自由空間入射光波矢.從圖2中可以看出SPs的色散曲線始終位于自由空間光波矢k0的右邊,并隨著頻率增加ksp與k0距離越來越遠,即SPs的波矢越來越大,波長越來越小,因此入射光波無法直接在金屬膜表面耦合激發SPs.為了有效激發SPs,必須對激發光的波矢進行補償,滿足激發所需的波矢匹配條件,才能激發SPs.下面簡要介紹SPs激發的幾種常用方法.

圖2 光在自由空間、電介質以及表面等離激元的色散關系曲線Fig.2.The dispersion relation curves of light in free space,dielectric and SPs.

2.2 表面等離激元的激發方法

2.2.1 棱鏡耦合法

這種方法是現在應用最多的一種表面等離激元激發方法.1968年,Otto[45]首次基于棱鏡的全內反射實現了表面等離激元的光學激發,如圖3(a)所示.接著Kretschmann和Raether[46]也報道了一種更加實用的棱鏡結構激發表面等離激元,如圖3(b)所示.入射光以不小于全反射角的角度入射,利用高折射率棱鏡(折射率np＞1)進行波矢補償.通過調節入射角度θsp,改變入射光波矢k0在x軸上的分量kx=k0npsinθ,使kx與SPs波矢ksp相等即可激發SPs,即滿足如下波矢匹配方程：

所以當沿金屬與空氣界面方向的光波矢分量在特定入射角度和波長條件下滿足波矢匹配方程(2)時,即可有效地激發SPs.

值得提出的是在金屬薄膜的上下兩個表面均可激發SPs.對于較厚的金屬膜,光子隧道效應很弱,這種情況Otto[45]的結構比較適合.在該結構中,全反射棱鏡和金屬膜有很小的空氣間隙(近場區域),依舊可在金屬和空氣間隙的界面上激發SPs.當金屬膜厚度減少到上下表面電磁模的相互作用(SPR的相互耦合)不能忽略時,SPs的色散關系會發生很大改變,此時表面等離激元共振頻率將產生分裂,分別對應對稱模式(低頻模式)、非對稱模式(高頻模式).對于較大的SPs波矢,分裂后的頻率可用(3)式描述：

其中d是金屬膜的厚度.同時,經過研究表明,因為對稱模式的波矢虛部隨厚度的減少而減少,其傳播距離也隨之增加,所以它也被稱為長程表面等離激元(long range surface plasmons,LRSPs)[47].

圖3 利用棱鏡耦合法激發SPsFig.3.Using prism coupling method to excite SPs.

2.2.2 近場散射激發方法

波矢匹配條件限制了遠場光波對近場SPs的耦合,而近場光波可以不受任何限制地耦合到SPs.采用尺寸遠小于波長的探針在近場范圍內掃描金屬表面,由于探針對光的散射作用,在探針附近存在近場倏逝波,其波矢范圍包含了SPs的波矢量,這樣其中一部分倏逝波就能夠實現波矢匹配從而激發SPs.同理,利用金屬表面的亞波長尺寸散射體(如凸起、凹槽等缺陷)也能激發SPs.圖4(a)為近場探針激發SPs的結構示意圖[48],圖4(b)為亞波長尺寸散射體激發SPs的結構示意圖[49].近場散射激發方法的優點是結構簡單、激發容易,缺點是只有很小一部分散射光能滿足SPs波矢匹配條件,所以激發SPs的效率比較低.

圖4 近場激發SPs示意圖[48,49]Fig.4.Schematic of exciting SPs by scattering wave[48,49].

2.2.3 光柵激發方法

最早關于SPs的報道就是采用光柵耦合激發的方法實現.光柵耦合是利用光柵對入射光波矢引入一個額外的波矢增量來實現SPs的波矢匹配.常用的光柵有一維光柵,二維光柵以及孔陣列結構和顆粒陣列結構[50].圖5顯示的是一維光柵結構激發SPs的示意圖,其波矢匹配方程為(4)式,其中θ為入射角,G=2π/Λ是光柵常數,Λ是光柵周期長度,m(=1,2,3,…)是光柵的級次.由于光柵的材料、幾何結構參數等都可以自由選定,可供研究的內容很豐富.這種方法激發SPs的效率較高,缺點是光柵結構制備成本較高,缺乏動態調控性.

圖5 光柵耦合激發SPs示意圖Fig.5.Schematic of exciting the SPs by grating coupling.

2.2.4 緊聚焦激發方法

近年來,使用高數值孔徑物鏡緊聚焦激發SPs的方法備受關注[51],其原理與棱鏡耦合法中Kretschmann[46]的結構相似,如圖6所示.將高數值孔徑的顯微物鏡通過油浸層靠近一個鍍有金屬薄膜的介質襯底,入射光波通過該物鏡聚焦到介質襯底/金屬界面.由于高數值孔徑物鏡能夠提供足夠大的入射角范圍,涵蓋了SPs激發所需要的共振角,從而能在SPs共振角位置滿足波矢匹配條件,激發SPs.此方法的優點是激發容易,只要物鏡提供的入射角范圍包含SPs共振角就自然能激發SPs,缺點是只有SPs共振角附近很小一部分入射光可以激發,絕大部分其他角度的入射光都被金屬膜反射了,所以激發SPs的效率比較低.這種激發方法能夠與傳統光學顯微系統相結合,因此被廣泛應用于生物顯微成像、傳感等領域.

圖6 利用高數值孔徑物鏡緊聚焦激發SPsFig.6.SPs excieted by highly focused laser beam.

2.3 結構光照明顯微術基本理論

結構光照明顯微成像技術屬于一種寬場成像技術,在提高成像速度方面比點掃描成像具有明顯優勢.初期的結構光照明顯微術主要用來提高光學顯微鏡的層析能力,并且由于只需對傳統顯微鏡稍加改造就可以實現結構光照明,因此它更為經濟,目前已經有商業公司提供結構光照明模塊,如Olympus的OptiGrid[52]和Zeiss的Apotome[53].結構光照明顯微術最早是通過在照明光路中加入一個正弦光柵來實現[15],利用壓電陶瓷控制器整體移動光柵來實現結構光的相移,但是這種機械移動裝置降低了系統的穩定性;后期利用可動態控制的空間光調制器[30-32]、數字微鏡器件(digital micromirror device)[54]來代替光柵,實現結構光照明.結構光照明不僅可以獲得層析成像能力,更重要的是利用結構光頻率和樣品頻率分量形成的莫爾條紋可以提高橫向分辨率.通過空間調制后的結構光照明樣品,將物場空間高頻率信息編碼,再通過計算提取高頻率信息,可將橫向分辨率提高到2倍于衍射極限頻率.需要說明的是橫向成像分辨率取值與結構光波矢正相關,因此提高結構光的波矢就提高了系統接收高頻信息的能力,也就提升了成像的空間分辨率.

2.3.1 結構光照明橫向分辨率原理

橫向的結構光照明為正弦分布：

(5)式經過傅里葉變換,可以在頻譜面上看到三個脈沖(δ)頻率分量：

在頻域內,定義源圖像的頻域為B(k),其反映的是熒光分子等樣品的濃度分布信息.必須指出的是,無論是結構光照明圖案的頻率I(k),還是源圖像的空間頻率B(k),都受到系統的衍射極限頻率限制OTF(k).故系統在頻域的輸出為O(k),其表示為

SIM系統所獲得的圖像空間頻譜實為寬場頻譜和衍射極限頻率外高頻信息所疊加產生的混合頻譜.為了復原超分辨頻譜的真實分布,首先需要將各頻譜分量B(k),B(k+k0)和B(k-k0)準確分離;再將已分離的高頻信息搬回原有的位置;最后,結合去卷積運算[55],獲得最優化的超分辨圖像顯示效果.基于以上分析可知,由于(6)式中共包含三個未知頻譜分量B(k),B(k+k0)和B(k-k0),至少需要構建三個獨立方程式以獲得未知數的精確解.顯然,在結構光調控過程中,相位是最合適的調制參數.選擇三個不同初相位{0,φ1,φ2}的結構光激發樣品,得到三項頻域內的輸出{O(k),O1(k),O2(k)},從而求得

經過算法重構,結構光系統最大的空間頻率可以達到系統衍射極限頻率的2倍,故可以將特定方向的空間分辨率提高一倍.同時改變相移方向,將所有方向獲得的高頻分量整合,可以將整個二維平面的分辨率都提高一倍.結構光照明在k矢量空間的表示如圖7所示.

圖7 結構光照明在k矢量空間的表示[56](矩形代表樣品k矢量空間的表示,為了簡單說明分成三個方向,縱向條紋為樣品的直接成像寬場信息,斜條紋代表樣品的高頻信息) (a)小圓圈表示系統點擴散函數的傅里葉變換,由于正弦照明,記錄強度是三個不同方向分量的總和的傅里葉變換,包含有縱向條紋物品信息與其他兩個斜條紋信息; (b)如果在圖像中記錄的三個信息分量被適當分開,它們可以用來提升分辨率Fig.7.E ff ect of the structured illumination in k-vector space[56](the rectangle represents the sample kvectors,the sample separation in three areasis simply illustrative)：(a)The small circles are the Fourier transform of the point spread function,because of the sinusoidal illumination,the Fourier transform of the recorded intensity is the sum of three di ff erent components,include with the wide- field information(vertical stripes),information from two more areas of the sample(diagonal stripes),is mixed in the recorded image; (b)if the three information components recorded in the image are properly separated,they can be used to increase the resolution.

2.3.2 表面等離激元結構光顯微成像基本原理

對于傳統SIM成像技術,其分辨率R可以寫成[26]：對于熒光光譜來說,λeimission≈ λexciatation,因此SIM成像分辨率接近λeimission/(4NA),即傳統衍射極限頻率的2倍.而PSIM技術將SIM與可調控的SPs干涉駐波條紋相結合,對于PSIM成像, λexciatation=λsp,根據圖2可知SPs波矢總大于激發光波矢,使得SPs駐波比激發光波長更短、頻率更高,因此將高頻的SPs條紋作為結構光可以顯著提升成像系統分辨高頻信息的能力.SPs條紋可以通過相向傳播的SPs波干涉形成駐波來產生,并可以通過調節SPs波的初始相位實現駐波的相移.圖8給出了PSIM成像波矢空間的示意圖.

圖8 PSIM波矢空間示意圖[56](黑色圓圈是波矢空間中的點擴散函數,圓越大表明分辨率越高) (a)初始點擴散函數;(b)通過四個方向(箭頭表示)SIM成像重建的點擴散函數,共有十二幅圖像獲取(每個方向的三幅圖像),得到更高的分辨率;(c)通過PSIM技術重建的點擴散函數,條紋由相向傳播的SPs波干涉生成,這些條紋超越光學分辨,對于一個連續點擴散函數,PSIM可實現衍射極限頻率三倍以上的成像分辨率Fig.8. Thek-vectorspacerepresentationsof PSIM[56](the black circles are the point spread functions in k space,the larger the circle the better the resolution)：(a)Original point spread function of the lens;(b)reconstructed point spread function via optical SIM for four directions(the arrows),twelve images are acquired(three for each direction)to reproduce a high resolution one;(c)reconstructed point spread function via PSIM,the illumination fringes are created from counter propagating SPs,these fringes beyond optically resolved,for a continuous point spread function,PSIM achieves triple better imaging resolution as the di ff raction limit.

3 表面等離激元結構光照明顯微術的研究進展

國際上對PSIM技術的研究,根據SPs條紋的產生與調控方法可分為兩類：一類是基于微納米金屬結構的PSIM,還有一類是基于全光激發與調控的PSIM.結構型的PSIM技術具有高效耦合、局域場增強的優勢,但同時透過結構的光對于成像會造成影響,并且因為結構固定,限制了結構光場的任意可調.全光型的PSIM技術具有高動態性、光場任意可調的優點,但其耦合效率較低.得益于納米加工技術的發展,基于納米尺度結構的PSIM相比較全光的PSIM可以實現更高的條紋空間頻率,理論上可以得到更高分辨率的PSIM成像,但也存在加工難度高等問題.

3.1 基于結構調制的PSIM介紹

2010年,美國加州大學圣地亞哥分校劉照偉教授在國際上首次提出PSIM的概念[26],并通過模擬分析了兩種結構的PSIM成像分辨率.兩種結構分別基于不同厚度的兩種金屬/介質膜,以銀膜作為金屬膜,水作為周圍介質.其中一種結構如圖9所示,銀膜厚度為100 nm(灰色區域),采用Kretschmann[46]結構激發方法,563 nm激發光以不同入射角激發產生SPs干涉圖樣并發生橫向位移.當入射激發角度分別為0°,4.6°和8°時,三種SPs干涉駐波場沿橫向呈現120°的相位差.該方法可用于暗場熒光成像,文中分析可實現3倍的成像分辨率提高.

圖9[26](a)—(c)SPs駐波干涉條紋的時間平均電能量密度分布,分別以0°,4.6°和8°作為激發角,三種干涉SPs駐波模式沿橫向方向呈現120°的相位差Fig.9.[26](a)–(c)The time-averaged electrical energy density distribution of the SP interference pattern with incident angle equal to 0°,4.6°,and 8.0°,respectively.The three interference patterns show 120°mutual phase di ff erence along the lateral direction.

第2種結構采用17 nm厚度的銀膜和光柵激發方法,通過優化的周期性Cr金屬納米孔結構去激發SPs[26],如圖10所示.納米孔結構可以產生類似光學Bloch波的SPs-Bloch模式,當m階SPs-Bloch波相向傳輸形成駐波條紋,條紋周期決定于納米孔的周期,其在矢量空間滿足kf=2(kS±mkg),這里kg為納米孔周期的倒數.因此可以通過縮小納米孔的周期長度來形成更為精細的SPs干涉駐波條紋,文中分析可實現4倍的成像分辨率提高.

2012年,袁小聰教授課題組[57,58]利用四方向金屬光柵結構實現了PSIM,具體結構如圖11(a)所示,其中光柵圍繞的中心區域面積是12μm×12μm.采用633 nm波長的線偏振的光學旋渦(optical vortex,OV)作為激發光弱聚焦于金屬光柵結構上,在中心區域內激發產生SPs駐波場,再通過調控入射光的相位(即OV光束的拓撲荷),實現SPs駐波條紋相移,致使熒光成像.這種實驗裝置簡單、重復性高,但由于成像視場范圍受限于SPs的傳播距離,中心成像區域面積較小,不利于大尺寸樣品的放置、對準測量.通過調整激發光的偏振方向,可以實現雙方向的PSIM成像,最終實現的成像分辨率達到172 nm,接近激發波長的1/4.

圖10[26](a)結構示意圖與SP干涉圖案(取電場能量密度分布的時間平均值);(b)干涉圖案的傅里葉變換;(c)對應的波矢空間表示;不同的顏色代表不同階照明圖案的波矢信息Fig.10.[26](a)Structure and SP interference pattern(time-averaged electric energy density distribution); (b)Fourier transform of interference pattern;(c)corresponding k space representations;di ff erent colors represent the information obtained from di ff erent orders of the illumination patterns.

圖11[58](a)四方向金屬光柵掃描電鏡圖像,可用于產生SPs莫爾條紋;(b)SPs駐波熒光顯微鏡原理圖; (c),(d)利用近場光學顯微鏡得到狹縫陣列結構中心區域的SPs駐波場的強度分布,其入射光偏振方向分別為x(c)和y(d)方向,(d)的插圖是采用二進制相位板插入光路光學顯微鏡中實現的SP駐波相移的條紋圖像Fig.11.[58](a)SEM image of four metallic gratings to generate plasmonic Moiré fringes;(b)a schematic diagram of the SP-SWF microscope;(c),(d)NSOM images of SP standing wave fi led intensity distributions in the central area of slit array structures with polarization of illumination light along x(c)and y(d) direction,respectively.Insertion in(d)is the NSOM image of phase-shifted SP standing wave fringe by using binary phase plate inserted into optical path.

2014年,劉照偉課題組在《Nano Letters》期刊上發表的文章展示了其PSIM技術的最近實驗研究成果[27].如圖12和圖13所示,他們在金屬膜上刻蝕了正交的細縫,形成了正方形狹縫陣列.每次入射光照明,正方形對邊將會激發產生相向傳播的SPs,疊加后形成SPs駐波的結構光用于熒光成像.他們又通過精確控制照明光的入射角度實現了駐波條紋的移動.而SIM二維超分辨成像的實現,則是由調節照明光的偏振實現,正交的偏振方向分別開關了正方形兩組對邊狹縫SPs的產生.這一技術使得成像分辨率提升了2.6倍,達到123 nm.

圖12[27]PSIM系統原理圖 在x-z與y-z平面的入射角度通過分別控制掃描電鏡S2和S1的旋轉實現,掃描電鏡S2放在透鏡1的焦平面上,樣品放置在透鏡2的焦平面上,插圖為樣品區域的放大圖Fig.12.[27]Schematics of the PSIM system.The illumination angle tuning in x-z and y-z planes are controlled by the rotation of the s2 and s1 mirror of the Galvo scanner,respectively,with the s2 mirror placed at the focal plane of lens 1 and the sample placed at the focal plane of lens 2.Inset：a magni fi ed view of the sample region.

圖13[27]樣品制備與表征 (a)PSIM基板的光學圖像,PSIM基板面積為2 mm×2 mm;(b)—(d)PSIM基板掃描電子顯微鏡圖像,狹縫陣列的圖像(b),(b)結構單元的掃描電子圖像(c),狹縫的進一步放大圖像(d);(e)SPs干涉結構示意圖,隨著入射角θ的變化,SPI干涉結構發生變化(由水平橫向黑色箭頭指示的方向);(f),(g)熒光強度與分別在x-z平面(f)和y-z平面(g)相對入射角的關系Fig.13.[27]Sample fabrication and characterization：(a)Optical image of a large PSIM substrate,the total PSIM substrate area is 2 mm×2 mm;(b)–(d)scanning electron microscope(SEM)images of a PSIM substrate,showing an array of the patterned slits(b),one unit cell(c)and a further magni fi ed view of the slits(d);(e)schematic illustration of the SPI tuning scheme,as the incident angle θ changes,the SPI pattern shifts laterally(direction indicated by the horizontal black arrow);(f),(g) fl uorescence intensity vs the relative incident angle in x-z(f)and y-z(g)plane,respectively.

此外,基于納米光學天線結構,劉照偉課題組又開發出一種局域表面等離激元結構光照明顯微成像技術(LPSIM)[29].不同于前面基于周期性狹縫結構的PSIM技術,利用納米天線激發的局域表面等離激元,其空間頻率可以任意獲取,理論上并沒有分辨率的極限.圖14為光學天線的結構示意圖[28],納米天線的直徑在60 nm,天線間距為150 nm,制作成六角形排布.圖中紅線表示照明激發光的p-偏振方向,通過改變激發光的入射角,即能實現SPs條紋的相移.結果顯示,LPSIM技術將圖像分辨力提高3倍,點擴散函數半高寬從153 nm降到52 nm.

2016年魚衛星課題組[59,60]理論研究了梯度介電常數人工結構在SIM成像中的應用.此人工結構由金屬與介質交替疊加組成,其多步相移通過調制入射角度得到,如圖15所示.采用532 nm激發光入射,可以得到SPs干涉駐波條紋周期達到84 nm,理想情況下可以實現亞45 nm的PSIM成像分辨率.這意味著相比較常規的熒光成像,可以實現5倍的成像分辨率提升.此類設計與之前劉照偉課題組[25]報道的結構類似,但創新性地采用了金屬與介質交替疊加的結構,進一步增加了等效折射率,降低了駐波條紋周期,提升了空間頻率.

圖14[29]LPSIM原理示意圖(紅色箭頭代表p偏振激光,以不同角度激發等離子基板,在天線后產生短程的近場激發模式)分辨率表征 PSFs(a)衍射受限系統和(b)LPSIM技術;(c)經過LPSIM重構之后的光學傳遞函數;(d)實心條紋物體;(e)衍射受限圖像;(f)LPSIM圖像Fig.14.[29]The Schematics of the LPSIM.The red arrow represents p-polarized laser light,directed towards the plasmonic substrate at varying angles to create near- field excitation patterns a short distance behind the antennas.Resolution characterization：PSFs of(a)a di ff raction-limited system,and(b)the LPSIM technique;(c)expanded OTF after LPSIM-reconstruction;(d)a solid striped object;(e)di ff raction-limited image;(f)LPSIM image.

圖15[59]在SIM使用的GPMS的示意圖和它的成像性能仿真結果 (a)由GPMS產生SPS的光學示意圖,兩列相向傳輸的表面等離激元形成駐波干涉條紋,用來激發在水膜中的量子點(或熒光珠);點擴散函數(b)的二(a)衍射受限系統,(c)x方向的重建圖像,(d)傳統的熒光顯微鏡圖像(藍色曲線)和利用GPMS實現的超分辨率圖像(紅色線)之間的半高寬比較;(e)x和y方向的重建圖像Fig.15.[59]The schematic diagram of the GPMS used in SIM and the simulation results of its imaging performance：(a)Optical con fi guration of SPs generated by GPMS,the standing interference pattern,which is generated by two adjacent counter propagating SPs,is used to excite the quantum dots(or fl uorescent beads)in the water fi lm;point spread function(b)a di ff raction-limited system,(c)x-direction reconstructed image,(d)FWHM comparison between conventional epi- fl uorescence microscope image(blue curve)and the super-resolution image using the GPMS(red line);(e)both x and y direction reconstructed image.

3.2 基于全光調制的PSIM技術

全光調控型PSIM技術利用入射光束整形產生特殊相位、偏振分布的新穎光束作為激發光源,選擇性地在均勻金屬/介質界面激發可重構的SPs駐波條紋,并進一步通過變化入射光束的相位、振幅、偏振來動態調控所激發的SPs條紋.此方法無須制備復雜的微納米金屬結構,簡單經濟,而且易與傳統的光學顯微系統相整合.此技術類似于已經報道的TIRF-SIM成像[25]手段,只是樣品的底層介質不同,相比較而言PSIM由于SPs波長短而具有更高的成像分辨率.

2009年,麻省理工大學的Chung等[61]發表了一項研究工作：將SPs應用于寬場熒光超分辨成像中,稱為駐波-表面等離激元熒光成像技術(SWSPRF).圖16為光學系統示意圖,使用激光波長為532 nm,在準直系統中置入偏振片,以此選擇激發光為p偏振或者s偏振.實驗中金膜蒸鍍在蓋玻片上,然后在金膜上又鍍了一層5 nm厚的二氧化硅.激發所使用的緊聚焦物鏡是45倍,數值孔徑為1.45,此時兩束激發光入射角度為44.7°,每束光都會激發SPs,兩束相向的SPs干涉產生駐波結構光照明體系,文中分析了此時對應的對比度為0.8.SIM技術中重要的環節之一就是控制結構光產生穩定相移,從而覆蓋整個成像區域,如圖所示, Chung等在一束激發光中加入了反饋調節裝置,穩定快速地完成了SPs條紋的相移過程.圖16(a1)為原始熒光像,(b1)為(a1)去卷積后得到的效果圖,(c1)和(d1)分別為三步相移的算法合成圖像以及合成后算法優化處理后的圖像,(d2)表征了最后得到的熒光點擴散函數(PSF)的截面數據,可以看出最終的成像分辨率達到124 nm.另外,此方法提高了信噪比,降低了熒光猝滅的可能性,可滿足生物醫學成像中的迫切需求.

2010年,袁小聰課題組[30]提出了基于表面等離激元旋渦的PSIM顯微成像技術.如圖17(a)所示,他們用高數值孔徑物鏡將OV聚焦在銀膜上,在銀膜上表面激發產生SPs旋渦駐波條紋,致使熒光成像.再利用OV光束的拓撲荷變化,實現了SPs駐波場的相移,如圖17(b)所示,拓撲荷從1—4變化,所對應的相移為0,2π/5,4π/5和 6π/5.這種裝置較Chung等實驗裝置更加簡單,重復性高.從圖17(c)熒光點擴散函數的截面數據可以知道,實驗最終實現的圖像分辨率為150 nm,與152 nm的理論分辨率符合得很好.

圖16[61]SW-SPRF實驗系統結構圖 SW-SPRF顯微在垂直方向的分辨率：(a1)初始熒光圖像,(b1)去卷積的SPRF圖像,(c1)基于三幅去卷積后的SPRF圖像實現SW-TIRF算法得到SW-SPRF圖像,(d1)線性去卷積降低SW-SPRF圖像的旁瓣;(a2)—(d2)比較了不同方法得到的選定區域PSF函數分布.比例尺,2μm;插圖直徑1.3μmFig.16.[61]Experimental setup of SW-SPRF microscopy.Extended-resolution imaging with SW-SPRF microscopy in vertical direction：(a1)Original SPRF image,(b1)deconvolved SPRF image,(c1)SW-SPRF image after applying the SW-TIRF algorithm on three deconvolved SPRF images,(d1)SW-SPRF image with linear deconvolution to reduce side lobes;(a2)–(d2)comparison of PSF pro fi les of various imaging methods at a selected region of interest (ROI).Scale bar,2μm;inset size 1.3μm across.

2015年,袁小聰課題組[31]進一步改進了PSIM系統,利用攜有分數拓撲荷的OV光束激發特定相移的SPs駐波場,同時對激發光束進行強度調制,激發出利于算法處理的一維駐波條紋.如圖18(a)所示,強度調制器為一蝴蝶形的光闌,如此一來,OV光分為對稱的兩束光,同時攜帶了相移的拓撲信息.如圖18(c)所示,拓撲荷分別為1, 1.66,2.34的OV光束進入激發系統后產生的駐波相移分別是-2π/3,0,2π/3.實驗處理后得到的點擴散函數截面半高寬(FWHM)為95 nm,國際上首次將全光調制型PSIM成像分辨率提高到100 nm以下.此項技術實現了近似平行的均勻SPs駐波條紋,解決了之前旋渦光束激發產生SPs條紋為圓形且不均勻的問題,為后期圖像處理帶來了較大的方便.

由于全光調制型PSIM大都高數值孔徑物鏡聚焦的SPs激發方法,其中只有SPs共振角附近很小一部分入射光可以用來激發,絕大部分其他角度入射光都被金屬膜反射了,所以激發SPs的效率比較低.2016年,袁小聰課題組[31]將新穎的完美渦旋光束(POV)引入PSIM系統,利用完美渦旋光束的環形邊帶非常窄的特點,將窄帶環形光束精確對應到SPs共振角度,從而讓更多的入射光能量被用于激發SPs駐波場.該項PSIM技術的優勢在于SPs激發效率比普通OV光束高很多,目前已實現了6.2倍的成像激發效率提升.此外,由于完美渦旋光束是窄帶環形光束,中心沒有激發光透過金屬膜,能較好地抑制背景噪聲,提高成像的信噪比.

圖17[30](a)光學旋渦聚焦銀薄膜所產生的表面等離激元激元的實驗系統示意圖;(b)具有不同拓撲荷l=1,2,3,4的線偏振光學旋渦光束x方向激發的表面等離激元駐波分布;(c)(a1)原始圖像,(b1)利用SPCE點擴散函數去卷積的SPRF圖像,(c1)應用sw-tirf算法和線性Richardson-Lucy去卷積后sw-sprf圖像;(a2)—(c2)為(a1)—(c1)選定區域的點擴散函數包絡Fig.17.[30](a)Aschematic diagram of experimental setup of SPPs generated by OV which focuses on the Ag thin fi lm; (b)excitation SPs standing wave pro fi le generated by a linearly polarized OV beam in x direction which carries the topological charge of l=1,l=2,(cl)=3,and dl=4.(c)(a1)original SPRF image,(b1)deconvolved SPRF image with SPCE PSF kernel,(c1)SW-SPRF image after applying SW-TIRF algorithm and linear Richardson-Lucy linear deconvolution; (a2)–(c2)comparison of PSF pro fi les at a selected ROI in(a1)–(c1).

該技術通過調節POV光束的分數階拓撲荷,實現SPs條紋相移的過程,如圖19所示,拓撲荷分別為1.33,2,2.66的POV光束實現0,2π/3,4π/3的相移過程,得到的成像分辨率為132 nm.

4 總結及展望

由于傳統顯微成像技術存在的衍射極限極大地制約了其應用范圍,如今有越來越多的新型成像技術被提出以突破這一限制.其中結構光照明顯微成像技術因其超分辨、寬場、快速成像的優勢,在生物醫學上的應用價值不可忽視.近些年來SIM技術結合表面等離激元的研究進展,發展出了PSIM技術.該技術將成像分辨率提高了衍射極限頻率的3到4倍,且其成像區域受限于金屬表面,背景噪聲弱,有較好的成像對比度.本文介紹的不同PSIM成像技術的綜合參數對比見表1.此外,PSIM技術還可以與其他顯微技術相結合產生更多應用,例如：由于SPs具有局域電磁場增強的特性,有報道將PSIM技術與Raman成像技術相結合實現表面增強拉曼的寬場成像[33,62];在理論上PSIM可以實現多種波長多色成像,可以使用感興趣的不同熒光分子來成像;同時PSIM技術可以通過增加激發功率,增強熒光分子的非線性效應,進一步提高成像分辨率,實現基于SPs的飽和吸收SIM成像.

圖18[31](a)利用振幅濾波器實現激發光變成為一對較小的半弧如綠色半弧所示;(b)在銀膜中心相向傳播SPS波形成一個標準的SP駐波模式;(c)利用分數階拓撲荷的光學旋渦實現精確的相移{-2π/3,0,2π/3}Fig.18.[31](a)The excitation position was cut to a smaller pair of arcs showed as green solid arcs by amplitude fi lter; (b)a standard SP-standing-wave pattern with uniform periodicity could be generated by two counter-propagate SPs waves toward the silver fi lm center;(c)precise phase shifts of{-2π/3,0,2π/3}achieved by OVs with fractional topological charges.

圖19[32](a),(b)PSIM系統的示意圖;(c)具有分數階拓撲荷的完美光學旋渦;(d)原始的熒光圖像;(e)經過三步相移算法重構得到的超分辨熒光圖像;(f)對應于(e)紅色線表示的強度分布,表明具有132 nm的成像分辨率Fig.19.[32](a),(b)Experimental setup for PSIM system;(c)perfect optics vortex with fractional topological charges; (d)origianl fl uorescence images;(e)super-resolved fl uorescence image by applied reconstructed algorithm to three inter media images;(f)the corresponding fl uorescence intensity cross-section in(e)shows the optical resolution(132 nm).

表1 不同PSIM成像技術的綜合參數對比Table 1.Comparison of di ff erent PSIM imaging techniques.

需要指出的是,雖然PSIM技術擁有諸多優勢,但其局限性也十分明顯：由于SPs是一種表面倏逝,所以其成像區域限定為距離金屬表面200 nm左右范圍內,只能實現近金屬表面樣品的二維平面成像;結構型PSIM成像可以實現更高的成像分辨率,但受限于結構固定,不易動態調控,且信噪比、成像維度也受到影響;全光型PSIM成像均采用高數值孔徑聚焦,成像區域受到SPs干涉區域大小的限制.并且現在已有的PSIM成像報道,主要是通過熒光小球進行分辨率的標定,尚缺乏對于實際生物樣品的檢測.同時現有PSIM成像研究都是基于一些基本的假設：如熒光強度與SPs條紋的相對線性相關;形成的SPs條紋周期不會因為表面熒光分子的分布產生變化;不考慮金屬表面對于熒光淬滅的影響等.所以現有的PSIM成像技術還遠不夠完善,仍有待于進一步深入研究和發展.相信隨著該技術的不斷研發和改進,這些難題終將被解決,最終形成可實用化的新型超分辨光學顯微成像儀器,為生物醫學成像領域做出突出貢獻.

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PACS:87.64.M—,65.40.gp,73.30.+y DOI:10.7498/aps.66.148701

Research progress of plasmonic structure illumination microscopy?

Zhang Chong-LeiXin Zi-Qiang Min Chang-Jun?Yuan Xiao-Cong?
(Nanophotonics Research Center,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China)

29 March 2017;revised manuscript

27 April 2017)

Structure illumination microscopy(SIM)is a novel imaging technique with advantages of high spatial resolution, wide imaging field and fast imaging speed.By illuminating the sample with patterned light and analyzing the information about Moiré fringes outside the normal range of observation,SIM can achieve about 2-fold higher in resolution than the di ff raction limit,thus it has played an important role in the field of biomedical imaging.In recent years,to further improve the resolution of SIM,people have proposed a new technique called plasmonic SIM(PSIM),in which the dynamically tunable sub-wavelength surface plasmon fringes are used as the structured illuminating light and thus the resolution reaches to 3–4 times higher than the di ff raction limit.The PSIM technique can also suppress the background noise and improve the signal-to-noise ratio,showing great potential applications in near-surface biomedical imaging.In this review paper,we introduce the principle and research progress of PSIM.In Section 1,we fi rst review the development of optical microscope,including several important near- field and far- field microscopy techniques,and then introduce the history and recent development of SIM and PSIM techniques.In Section 2,we present the basic theory of PSIM,including the dispersion relation and excitation methods of surface plasmon,the principle and imaging process of SIM,and the principle of increasing resolution by PSIM.In Section 3,we review the recent research progress of two types of PSIMs in detail.The fi rst type is the nanostructure-assisted PSIM,in which the periodic metallic nanostructures such as grating or antenna array are used to excite the surface plasmon fringes,and then the shift of fringes is modulated by changing the angle of incident light.The resolution of such a type of PSIM is mainly dependent on the period of nanostructure, thus can be improved to a few tens of nanometers with deep-subwavelength structure period.The other type is the alloptically controlled PSIM,in which the structured light with designed distribution of phase or polarization(e.g.optical vortex)is used as the incident light to excite the surface plasmon fringes on a fl at metal fi lm,and then the fringes are dynamically controlled by modulating the phase or polarization of incident light.Without the help of nanostructure, such a type of PSIM usually has a resolution of about 100 nm,but bene fi ts from the structureless excitation of plasmonic fringes in an all-optical con fi guration,thereby showing more dynamic regulation and reducing the need to fabricate nanometer-sized complex structures.In the fi nal Section,we summarize the features of PSIM and discuss the outlook for this technique.Further studies are needed to improve the performance of PSIM and to expand the scope of practical applications in biomedical imaging.

structure illumination microscopy,super-resolution imaging,surface plasmon

:87.64.M—,65.40.gp,73.30.+y

10.7498/aps.66.148701

?國家自然科學基金(批準號：61427819,61422506,61605118)、國家重點基礎研究發展計劃(批準號：2015CB352004)和國家重點研發計劃(批準號：2016YFC0102401)資助的課題.

?通信作者.E-mail：cjmin@szu.edu.cn

?通信作者.E-mail：xcyuan@szu.edu.cn

?2017中國物理學會Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61427819,61422506,61605118),the National Basic Research Program of China(Grant No.2015CB352004),and the National Key Research and Development Program of China(Grant No.2016YFC0102401).

?Corresponding author.E-mail：cjmin@szu.edu.cn

?Corresponding author.E-mail：xcyuan@szu.edu.cn