褪黑素受體1A基因rs13140012位點T基因多態性增加特發性草酸鈣結石易感性風險

陳立紅，郝 鵬，巢玉娣，邵秋陽，陳方進，章永堅，習海波

褪黑素受體1A基因rs13140012位點T基因多態性增加特發性草酸鈣結石易感性風險

陳立紅1，郝 鵬2，巢玉娣1，邵秋陽1，陳方進1，章永堅1，習海波3

（1.都昌縣人民醫院泌尿外科，江西 九江 332600；2.武漢市普愛醫院泌尿外科，湖北 武漢 430032；3.南昌大學第一附屬醫院泌尿外科，江西 南昌 330006）

目的 研究褪黑素受體1A基因rs13140012位點A/T多態性與特發性草酸鈣結石的關系。方法 根據納入和排除標準，在江西省漢族人群內，進行相關試驗研究。采用RT-PCR技術監測研究對象外周血中MTNR1A的基因多態性。結果 共納入260例研究對象，其中特發性草酸鈣結石（ICOS）患者115例和對照組145例。試驗組與對照組兩組基線可比：性別、年齡和體重指數差異無統計學意義。SNP rs13140012位點A等位基因頻率在ICOS組和健康對照組分別為：86%VS 95.2%。T等位基因頻率分別為14%VS 4.8%。ICOS和健康人群相比，SNP-A與SNP-T的基因頻率有顯著的差異（P＜0.001）。結論 MTNR1A基因rs13140012位點A/T與ICOS易感性存在相關性，T是特發性草酸鈣結石的危險因素。

尿石癥；特發性草酸鈣結石；褪黑素受體；單核苷酸多態性；易感性

特發性草酸鈣結石（Idiopathic calcium oxalate stones，ICOS）是多基因疾病，ICOS的發生、發展及復發，與多個基因存在相關性，并受到基因-基因之間和基因-環境的交互作用所影響[1-3]。目前研究發現褪黑素受體1A（MTNR1A）基因與多種疾病相關，在早期研究中發現，其可能影響著泌尿系結石的發生。本研究擬對MTNR1A基因rs13140012位點A/T多態性與ICOS易感性的關系進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 試驗通過醫院醫學倫理協會論證。（1）ICOS組：納入標準，①在本中心就診，完善相關檢查，臨床明確診斷為泌尿系結石，接受藥物排石或手術治療；②所取得的泌尿系結石標本，采用結石紅外光譜分析系統進行結石成分分析，明確診斷為草酸鈣結石（一水草酸鈣或二水草酸鈣）；③研究對象知情同意并簽署相關知情同意書。排除標準，①有家族遺傳性疾??；②糖尿病及其他內分泌系統疾病；③其他影響泌尿系結石慢性?。郝阅c道疾病、甲狀旁腺功能亢進、尿路梗阻等[4]。（2）健康對照組：納入標準，①健康體檢成人，年齡大約18周歲；②知情告知，簽知情同意書。排除標準：①家族遺傳性疾??；②糖尿病及其他內分泌系統疾?。虎燮渌绊懨谀蛳到Y石慢性?。喝缒虻滥[瘤、尿道梗阻、甲狀旁腺功能亢進癥、慢性結腸炎。最終共有260例研究對象納入研究，其中ICOS患者115例，健康對照人群145例。兩組人群性別、年齡及體重指數比較差異無統計學意義，具有可比性。見表1。

表1 試驗組與對照組年齡、性別和體重指數比較

1.2 方法

1.2.1 結石成分使用結石紅外光譜分析系統（天津藍莫德公司），經手術或藥物排石后獲取結石標本，取結石標本的核心部分進行成分分析。

1.2.2 MTNR1A基因rs13140012位點A/T多態性分析 （1）血DNA提?。翰捎脗鹘yChelex-100方法提取外周血DNA。檢測DNA濃度及OD260/280值；最終所有DNA標本稀釋至20-50ng/μL，-20℃儲存備用。

（2）PCR擴增：生工生物工程（上海）有限公司合成引物：

上游引物為：MTNR1A rs13140012-A(F)5'GCGGGCCTAAGTAAATCTACAGGA 3'

MTNR1A rs13140012-T(F) 5' GCGGGCAGGGCGGCCTAAGTAAATCTAC AGGT 3'

下游引物為：

MTNR1A rs13140012(R)5'AGGATTGCAGTGTGGGATTTCTA 3' SYBR Green PCR反應體系：

體積（μL）10 1 0.25 0.25 0.25 6反應條件：成分Just SYBR Premix DNA引物SNP-UP-A(5μM) SNP-UP-T(5μM) SNP-Low(5μM) DEPC-treated water 95℃10 min 35 95℃ 5 s 58℃ 15 s 72℃ 15 s預變性循環數變性退火延伸

1.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件分析。計量資料以“x±s”表示，進行獨立樣本t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測 目的基因擴增后，根據溶解曲線，確定基因分型：MTNR1A基因rs13140012位點A/T。見圖1、圖2。

2.2 MTNR1A基因rs13140012位點A/T多態性與結石易感性相關性分析 MTNR1A基因rs13140012位點A基因和T基因，在ICOS組與健康人群分布差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 ICOS與對照組中的A/T等位基因頻率

3 討論

泌尿系結石是最常見的泌尿外科疾病之一，嚴重的影響人類健康和生活質量。世界范圍內其發病率為2%～20%[5]。所有的泌尿系結石中，60%～80%為含草酸鈣的結石。臨床上，少數草酸鈣結石是由單基因遺傳引起的，還有一部分是繼發性結石（如胃腸道疾病引起），其余的絕大多數草酸鈣結石是ICOS[6]。目前大多數學者認為：ICOS是多基因遺傳疾病，其發生、發展和復發與多個基因的SNP存在相關性，并且受到基因-基因之間、基因-環境之間得交互作用影響。目前已報道的與泌尿系結石發病相關的一些基因包括：如血管內皮生長因子（VEGF）[7]、骨橋蛋白基因（OPN）[8]、尿激酶[3]等。這些SNP的發現為結石的形成機制研究提供了基因水平的證據。

褪黑素（MEL）是主要是由位于下丘腦的松果體分泌的吲哚胺類激素，具有重要生理功能的激素；有少部分MEL由視網膜分泌。目前，已經在多個物種的多個組織中檢測到，并且能維持明顯的晝低夜高的節律變化。不僅可以提高機體免疫能力，也有報道認為MEL是一種高效的自由基清除劑和抗氧化劑，這些生理功能的發現，提示可能于泌尿系結石形成有關。在哺乳動物體內體內，MEL受體有兩型：α細胞中的MEL受體1A（MTNR1A）和β細胞中的MEL受體1B（MTNR1B）；MTNR1A的分布比MTNR1B更為廣泛，兩個受體介導了褪黑素不同生理活性。人類MTNR1A基因位于染色體4q53.1，有兩個外顯子，編碼350個氨基酸的蛋白。目前研究認為：褪黑素的主要生理學功能是由MTNR1A基因介導的[9-10]。

隨著MEL及MTNR相關作用機制的研究進展，其生理功能逐漸被學者所認識。MTNR1A基因的多態性和性狀關聯分析是目前研究的重點：目前研究認為MTNR1A基因的改變與某些先天性疾病的發生有關，或導致后天性疾病的發生率增加，如：睡眠紊亂、精神分裂、多囊卵巢及糖尿病等[11-13]。與目前關于MTNR1A基因多態性與泌尿系結石相關性研究較少。本研究通過對江西省人群范圍內，對比ICOS和健康人群中MTNR1A基因SNP rs13140012多態位點在等位基因頻率上的差異，探討MTNR1A基因與特發性草酸鈣結石的相關性，擬為ICOS的發生、發展及治療提供理論學依據。我們的目前研究結果發現：ICOS組，rs13140012多態位點T基因攜帶者的患病風險率明顯高于A基因，說明MTNR1A基因可能是特發性草酸鈣結石的易感基因，與ICOS的易感性存在相關性。Esposito Teresa[14]等與2012年也報道了想類似的研究結果。

由于客觀條件限制，本研究最終納入260例研究對象，能從一定程度上發現相關情況，但尚需在后續研究中進行更大范圍的人群普查，以擴大研究結論和增強驗證強度。另外，由于泌尿系結石初發和復發人群存在差異性，故基因可能存在部分差異，后期需進行分組研究，以提高論證依據，用于病因預防及治療。本研究結果發現MTNR1A基因rs13140012多態位點A/T多態性和特發性草酸鈣結石易感性的關系，在一定程度上為泌尿系結石的研究提供了基因水平的證據。隨著MEL和MTNR的不斷研究進展，必定會為草酸鈣結石的精準治療提供了新的方向和治療靶點。但此次報道僅為我們的初步研究結果，進入臨床應用尚需要我們的深入研究。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2017.22.034

2016年九江市科技局課題19號

習海波，E-mail：13870834578@163.com