利用豆制品廢水發(fā)酵枯萎病拮抗菌Pb-4條件研究

郭珺 武愛(ài)蓮 閆敏 龐金梅 焦曉燕

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所 土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

利用豆制品廢水發(fā)酵枯萎病拮抗菌Pb-4條件研究

郭珺 武愛(ài)蓮 閆敏 龐金梅 焦曉燕

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所 土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

利用豆制品生產(chǎn)過(guò)程中的廢水（黃漿水）對(duì)枯萎病拮抗菌Pb-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選Pb-4菌株黃漿水培養(yǎng)基中的碳源；設(shè)置因素水平為L(zhǎng)18（35）正交試驗(yàn)，對(duì)Pb-4菌株黃漿水培養(yǎng)基中最佳碳源和無(wú)機(jī)鹽成分進(jìn)行篩選和優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方；通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)Pb-4菌株的發(fā)酵溫度、pH和接種量進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，通過(guò)篩選確定玉米粉為黃漿水培養(yǎng)基的最佳碳源；優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉 30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g；優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：溫度 36.3℃、pH7.4、接種量 5%、搖瓶培養(yǎng)40 h。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵菌數(shù)可達(dá)42.8×108CFU/mL、最大生物量OD660值為0.393，與預(yù)測(cè)理論最大值0.390 2相吻合。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基能夠替代蛋白胨、酵母粉和葡萄糖等常規(guī)培養(yǎng)基，具有簡(jiǎn)單、廉價(jià)和環(huán)保等特點(diǎn)，可作為微生物菌劑規(guī)模化生產(chǎn)的原料。

黃漿水；解淀粉芽孢桿菌；番茄枯萎病菌；拮抗菌株；發(fā)酵條件優(yōu)化

隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，連作及大量使用化肥農(nóng)藥，使設(shè)施土壤養(yǎng)分失衡，土壤酸化，土傳病害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重制約了設(shè)施生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展［1］。目前，主要通過(guò)生物、農(nóng)業(yè)和工程三種調(diào)控措施進(jìn)行設(shè)施土壤的改良。在生物途徑中，有益微生物通過(guò)各種間接或直接的方式抑制植物病原菌繁殖，減輕土傳病害的發(fā)生，緩解連作障礙等設(shè)施土壤質(zhì)量問(wèn)題［2］。針對(duì)設(shè)施生產(chǎn)中土壤修復(fù)、植病防控已有多種應(yīng)用微生物生產(chǎn)的制劑，如CN100999667公開了一種設(shè)施菜地土壤改良劑及其制備方法與應(yīng)用，強(qiáng)調(diào)作為土壤改良劑，菌劑中菌種的配比和固體菌劑載體的配比，菌劑單獨(dú)發(fā)酵活菌數(shù)為1×108CFU/ mL［3］。CN101948771A公開了防病促生植物內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用，強(qiáng)調(diào)在牛肉膏、酵母膏和葡萄糖培養(yǎng)液中可獲得菌數(shù)（2-4）×108CFU/mL的發(fā)酵液，含2種抗菌物質(zhì)，菌液稀釋50倍處理水稻種子，對(duì)水稻惡苗病溫室防效達(dá)到84.6%以上［4］。上述兩種制劑中，前者發(fā)酵液菌數(shù)偏低，用量和成本必然會(huì)加大；后者處理種子時(shí)使用的菌液濃度也較高，用量和成本也較高。如果能將發(fā)酵菌液的活菌數(shù)和活性提高，減少使用量，降低生產(chǎn)成本，將大大節(jié)約能源和資源，利國(guó)利民。

豆制品廢水（黃漿水）中富含氮、磷、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分，如不經(jīng)處理直接排出，對(duì)環(huán)境具有潛在影響［5］。據(jù)調(diào)查，太原市年排黃漿水大約在4.3萬(wàn)t以上，而每噸黃漿水如進(jìn)行處理需投資3元左右（不包括排污工程和設(shè)備投資）。目前，國(guó)內(nèi)相關(guān)發(fā)明專利提到黃漿水主要應(yīng)用于生產(chǎn)飼料、飲料、白酒、醬油、維生素B12、酒精、乳酸、谷氨酸、核黃素和蝦青素等領(lǐng)域，發(fā)酵用菌株有乳酸菌、酵母菌和白地霉等。如CN200610045614.7公開了利用黃漿水培養(yǎng)富含蝦青素的紅發(fā)夫酵母的方法，利用獲得的細(xì)胞及從中提取的蝦青素制備飼料添加劑［6］。因此，有效利用黃漿水中的營(yíng)養(yǎng)成分生產(chǎn)微生物菌劑，既可降低菌劑生產(chǎn)成本，又是解決廢水再利用的一項(xiàng)既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保的措施。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）屬芽孢桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣性較高的細(xì)菌。其作為植物根際有益微生物，通過(guò)分泌拮抗物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害方面發(fā)揮著多種有益的作用［7-9］。大量研究表明，一些芽孢桿菌可以產(chǎn)生對(duì)植物病原真菌有抑制作用的抗菌物質(zhì)，主要包括低分子量的抗生素如肽類、脂肽類、細(xì)菌素以及高分子量蛋白質(zhì)類抗菌物質(zhì)等［7，10-12］，具有的廣譜抗菌功能，為其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供了巨大的可能。目前對(duì)解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化的研究很多［8-13］，而本研究旨在利用黃漿水，對(duì)一株具有促生抑菌功能的解淀粉芽孢桿菌Pb-4的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后該解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Pb-4菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）由本課題組前期篩選對(duì)番茄枯萎病菌具有較好抑制效果，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基斜面保存。fq菌株：番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiici）由本課題組分離自日光溫室自然發(fā)病株，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基斜面保存。

1.1.2 制備培養(yǎng)基試劑與材料 蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，黃漿水，玉米粉等。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將保存的Pb-4菌株斜面接種于種子培養(yǎng)基（0.5% 蛋白胨，0.5% 酵母粉，1.5%葡萄糖，pH 7.0-7.2）中，180 r/min、28℃ 搖床培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2 供試黃漿水化學(xué)特性 實(shí)驗(yàn)選用工藝穩(wěn)定的山西老字號(hào)“六味齋”豆制品加工廠的黃漿水，經(jīng)15 min煮沸、八層紗布過(guò)濾后，相關(guān)成分與1.2.1中種子培養(yǎng)基進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。N含量采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定；P含量采用釩鉬黃法紫外分光光度計(jì)測(cè)定；K含量采用火焰光度計(jì)測(cè)定［14］。

表1 黃漿水與種子培養(yǎng)基成分比較（mg·L-1）

從表1中可以看出，黃漿水與細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分比較接近，可以作為解淀粉芽孢桿菌Pb-4液體發(fā)酵的水相，可不添加氮（N）、磷（P）、鉀（K），需調(diào)節(jié)pH值，添加適量的碳源和無(wú)機(jī)鹽。

1.2.3 黃漿水發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素篩選 將黃漿水煮沸后過(guò)濾，去除濾渣，分別加入1.5%的不同碳源（葡萄糖、蔗糖、白砂糖、麥芽糖、玉米粉），分裝后1×105Pa滅菌20 min，備用。初始培養(yǎng)條件為：pH 7.0，250 mL三角瓶中的裝液量為100 mL，接種量3%，于180 r/min、28℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h。以不添加碳源的黃漿水作對(duì)照，測(cè)定培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)添加不同碳源處理Pb-4 菌株活菌數(shù)，并檢測(cè)抑菌活性。在滅菌后的培養(yǎng)皿中加入1 mL fq菌液，隨后將冷卻至約45℃熔融態(tài)的PDA固體培養(yǎng)基倒入平板，搖勻，待凝固后，用濾紙片蘸取不同碳源培養(yǎng)的Pb-4菌液20 μL，以對(duì)角線方向貼于含fq菌液的PDA平板上，同時(shí)將蘸有無(wú)菌培養(yǎng)液的濾紙片貼于平板中心作為對(duì)照CK，28℃培養(yǎng)。觀察并記錄抑菌圈直徑，檢測(cè)不同碳源培養(yǎng)的Pb-4對(duì)fq的抑菌活性［15，16］。每個(gè)處理重復(fù) 3 次。從而篩選最佳碳源。

1.2.4 芽孢產(chǎn)生時(shí)間測(cè)定 活化Pb-4 菌株，按3%接種量接種于最佳碳源黃漿水液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)，從24 h開始，每2 h取菌液涂片進(jìn)行芽孢染色，觀察芽孢生成情況，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中無(wú)芽孢菌體數(shù)、有芽孢菌體數(shù)、離體芽孢數(shù)［17］，每次4個(gè)重復(fù)。

1.2.5 黃漿水培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽成分優(yōu)化選擇 為了進(jìn)一步優(yōu)化提高培養(yǎng)物的效價(jià)，設(shè)置因素水平為L(zhǎng)18（35）正交試驗(yàn)，對(duì)黃漿水培養(yǎng)液中最佳碳源用量和無(wú)機(jī)鹽添加比例進(jìn)行優(yōu)化［18］。正交實(shí)驗(yàn)各因素及水平見表 2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)置

1.2.6 菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定 以660 nm菌液的吸光度（OD660）表示菌體的生物量。菌液10 000 r/min離心10 min，取上清，以不接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，在1 cm比色杯中于分光光度計(jì)上測(cè)定OD660。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 利用1.2.5中的最佳培養(yǎng)基，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)置3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以培養(yǎng)溫度、pH和接種量為自變量，以菌體生物量為響應(yīng)值進(jìn)行培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)［19、20］。

1.2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 利用1.2.5中的最佳培養(yǎng)基和1.2.7優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，確定最終優(yōu)化結(jié)果。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 用Design-Expert分析軟件進(jìn)行多元二次回歸模型方程的建立，并作出響應(yīng)面圖，進(jìn)一步通過(guò)數(shù)據(jù)優(yōu)化程序，求得當(dāng)響應(yīng)面值最大時(shí)，培養(yǎng)條件各因素的最優(yōu)水平。

2 結(jié)果

2.1 黃漿水中添加不同碳源對(duì)Pb-4抑菌活性、活菌數(shù)和芽孢形成的影響

在黃漿水中分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、白砂糖和玉米粉5種不同碳源，測(cè)定活菌數(shù)，并檢測(cè)抑菌效果，結(jié)果見表3。與其它碳水化合物相比，添加玉米粉不僅菌數(shù)多，抑菌效果好，芽孢形成率也較高，說(shuō)明玉米粉中所含有的其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于Pb-4菌株的快速繁殖與生長(zhǎng)。為此，在黃漿水液體培養(yǎng)基中選擇玉米粉為最佳碳源。

表3 不同碳源對(duì)Pb-4發(fā)酵的影響

2.2 Pb-4菌芽孢的產(chǎn)生時(shí)間確定

由于芽孢生成量決定產(chǎn)品的最終質(zhì)量，因此利用黃漿水玉米粉培養(yǎng)基對(duì)Pb-4菌培養(yǎng)時(shí)間與芽孢生成的關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果見圖1。Pb-4菌搖瓶培養(yǎng)30 h時(shí)芽孢開始生成，40 h時(shí)含芽孢菌體達(dá)到最多，之后隨著芽孢的脫落，離體芽孢數(shù)逐漸增加，54 h后沒(méi)有芽孢菌體存在。

2.3 黃漿水玉米粉培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽成分優(yōu)化選擇

為了進(jìn)一步優(yōu)化提高培養(yǎng)物的效價(jià)，設(shè)置了因素水平為L(zhǎng)18（35）正交試驗(yàn)（表2），對(duì)黃漿水玉米粉培養(yǎng)液中玉米粉及無(wú)機(jī)鹽成分進(jìn)行優(yōu)化，確定液體培養(yǎng)基配方，結(jié)果見表4、表5。優(yōu)化后的Pb-4菌培養(yǎng)基組成：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g。發(fā)酵菌數(shù)可達(dá)38.4×108CFU/mL。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)置3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。以培養(yǎng)溫度、pH和接種量為自變量，以菌體生物量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。選擇培養(yǎng)基pH為7.0±5，培養(yǎng)溫度（35±5）℃、接種量（5±2）%和菌株生物量（OD660）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，見表6；測(cè)定數(shù)據(jù)見表7。

圖1 黃漿水玉米粉培養(yǎng)基對(duì)Pb-4菌芽孢生成的影響

表4 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

表7 Box-Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到三元二次回歸方程如下：Y=0.17237-0.00433A-0.01028B-0.0387C-0.021 86A2-0.03219B2-0.02981C2-0.00041AB -0.00011AC-0.00108BC。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表 8 所示。繪制響應(yīng)面曲線見圖2。

通過(guò)解析分析，由RSM預(yù)測(cè)Pb-4菌株最佳培養(yǎng)條件為：溫度 36.29℃；pH 7.38；接種量 5%時(shí)，其理論最大生物量OD660值為0.3902。

表8 Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.5 驗(yàn)證結(jié)果

利用2.3中的最佳培養(yǎng)基配方和2.4中的最佳培養(yǎng)條件，進(jìn)行了5次搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定OD660平均值為0.393±0.008 7，說(shuō)明在精確操作的條件下，該實(shí)驗(yàn)條件具有較好的重復(fù)性，與預(yù)測(cè)的理論最大生物量相吻合，同時(shí)測(cè)定了發(fā)酵菌數(shù)平均值為（42.8±0.2）×108CFU/mL，確定解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌株優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉 30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g；優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：溫度 36.3℃、pH7.4、接種量 5%、搖瓶培養(yǎng)40 h。

3 討論

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌，能抑制尖孢鐮刀菌等多種植物病原真菌［11］。因此，在防治病原菌的微生物菌劑的研制方面，研究人員對(duì)解淀粉芽孢桿菌的研究越來(lái)越多。為了更好產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，首先要對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。權(quán)春善等［11］確定解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為：以葡萄糖、NH4Cl、MgCl2、牛肉膏為培養(yǎng)基，最適培養(yǎng) pH 值為 6.0、溫度為33℃；李娟等［13］確定解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為：以馬鈴薯、蔗糖、黃豆粉、MgCl2為培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為溫度 30℃、初始 pH 5；劉京蘭等［15］確定解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為：以可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl 為培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)條件：pH 6.0、28℃；梁昌聰?shù)龋?0］確定解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為：以蔗糖、尿素、豆粕和多種無(wú)機(jī)鹽為培養(yǎng)基。上述研究結(jié)果表明不同菌株的最佳發(fā)酵條件不同，且解淀粉芽孢桿菌可利用各種不同的培養(yǎng)成分生長(zhǎng)，但利用黃漿水發(fā)酵解淀粉芽孢桿菌的研究還未見報(bào)道。

本課題組的相關(guān)研究表明，解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌株可以在土壤和植物體內(nèi)定殖；其發(fā)酵液對(duì)多種植物土傳真菌性病害具有良好的防控效果和明顯的促生長(zhǎng)作用［7］。Pb-4菌株發(fā)酵液的生產(chǎn)將廢棄物資源化利用，施用后可減少或替代化學(xué)農(nóng)藥的使用，安全無(wú)毒，屬環(huán)境友好型制劑，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)和可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求。下一步將繼續(xù)利用5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵模擬實(shí)驗(yàn)，對(duì)解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌的發(fā)酵條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，并在1 t發(fā)酵罐中進(jìn)行小試，以期早日實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

圖2 A（培養(yǎng)溫度）、B（pH）、C（接種量）交互響應(yīng)曲面圖

4 結(jié)論

本文通過(guò)系統(tǒng)研究，了解掌握了利用豆制品黃漿水添加玉米粉，培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌的優(yōu)化培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉 30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g；優(yōu)化后的發(fā)酵條件為：溫度 36.3℃、pH 7.4、接種量 5%、搖瓶培養(yǎng)40 h，理論最大生物量OD660值為0.390 2，實(shí)測(cè)OD660值為0.393，發(fā)酵菌數(shù)可達(dá)42.8×108CFU/mL。優(yōu)化的培養(yǎng)基的獨(dú)到之處是替代了蛋白胨、酵母粉、葡萄糖等常規(guī)培養(yǎng)基；其工藝簡(jiǎn)單、廉價(jià)、環(huán)保，具有較好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Fermentation Conditions of Antagonistic Bacterium Pb-4 Against Fusarium Wilt Using Soybean Processing Wastewater

GUO Jun WU Ai-lian YAN Min PANG Jin-mei JIAO Xiao-yan
（Institute of Agricultural Environment & Resources，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Soil Environment & Nutrient Resources of Shanxi Province，Taiyuan 030031）

The wastewater from soybean processing（yellow serofluid）was used to optimize the fermentation medium condition of antagonistic bacterium Pb-4 against fusarium wilt. The single factor experiments were conducted to screen the carbon source of Pb-4 strain in yellow serofluid medium. Orthogonal experiments L18（35）were designed to select the optimal carbon source and inorganic components for Pb-4 strain in yellow serofluid medium，and determine the optimal fermentation medium formulation. The fermentation temperature，pH and inoculation amount of Pb-4 strain were optimized by response surface method（RSM）. As results，the composition of the optimal medium was yellow serofluid 1 000 mL，corn flour as the optimal carbon source 30 g，（NH4）2SO42 g，MgSO41.5 g，CaCO31.5 g and FeSO40.3 g. The fermentation conditions after optimization were as：temperature 36.3℃，inoculum size 5%，pH 7.4 and incubation time 40 h. Under the optimized conditions，the number of fermented bacteria was up to 42.8×108CFU/mL，and the maximum biomass OD660was 0.393，which was in accord with the predicted value 0.390. In conclusion，the optimized medium can be as an effective substitute for traditional medium like peptone，yeast powder，glucose，etc.，moreover as it is simple，cost-efficient and environmentally friendly，thus it can be used as raw material for the scale production of microbial agents.

yellow serofluid；Bacillus amyloliquefaciens；Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiici；antagonistic bacteria；fermentation condition optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0159

2017-03-03

山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（FT201402-15），山西省專利推廣實(shí)施資助專項(xiàng)（20161016）

郭珺，女，碩士，副研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)微生物資源利用；E-mail：13935163790@163.com