外源DNA在哺乳動物細胞中不依賴于啟動子的轉錄和剪接現象

徐文楊華瑜鄭永昌

（1. 清華大學生命科學學院，北京 100084；2. 中國醫學科學院北京協和醫院肝臟外科，北京 100730）

外源DNA在哺乳動物細胞中不依賴于啟動子的轉錄和剪接現象

徐文1楊華瑜2鄭永昌2

（1. 清華大學生命科學學院，北京 100084；2. 中國醫學科學院北京協和醫院肝臟外科，北京 100730）

外源性導入哺乳動物細胞的雙鏈DNA會經歷重組、重排及其他復雜的分子生化反應。極少數DNA分子會隨機整合到宿主基因組，即發生水平基因轉移。然而，目前還不清楚這些外源性DNA分子在不含有特殊啟動子的情況下是否能被細胞的轉錄機器識別并起始轉錄。在構建環狀RNA（circRNA）表達體系的過程中，發現了外源性DNA分子能經歷不依賴啟動子的轉錄，而且轉錄本會發生符合“GU-AG”法則的RNA剪接進而產生類似于環狀RNA的異常剪接分子。進一步研究表明，外源DNA在哺乳動物細胞中不依賴于啟動子的轉錄和剪接現象是保守的。揭示了外源DNA在哺乳動物細胞中的一個新的命運途徑，該發現對研究外源性DNA對宿主細胞的影響具有重要意義及應用價值。

不依賴啟動子的轉錄；RNA剪接；circRNA；DNA轉染；選擇性剪接

早期研究發現，導入真核細胞的外源DNA分子可以發生重組、重排及其他復雜的分子生化反應，可能形成長達幾百kb的頭尾串聯結構［1-7］。在哺乳動物卵子和受精卵中微注射的DNA也能通過這種方式形成類似的高分子化合物結構［8，9］。然而，對于這些DNA能否在缺乏功能性啟動子下進行轉錄及其后轉錄本的剪接缺乏尚不清楚。

根據報道，一類稱為coligo（Circular oligonucleotides，環狀寡核苷酸小體）的單鏈環狀DNA導入哺乳細胞后能被RNA聚合酶III識別并進行不依賴于啟動子轉錄，產生功能性RNA分子［10］。其后的研究表明，coligo的有效轉錄也需要相關序列和結構的參與［11］。通過轉錄組測序發現導入哺乳動物細胞的無啟動子DNA上存在部分區域的異常轉錄峰，具體機制尚不明確，也可能是在轉錄測序過程中存在DNA污染［12］。

我們在研究環狀RNA的生成過程中偶然發現了不依賴于啟動子的轉錄以及其后轉錄本的剪接現象。circRNA是近年發現的一類共價閉合的環狀非編碼RNA分子，其在細胞中的檢測主要使用反向引物對進行RT-PCR［13-15］。本研究以cirRNA在人細胞中的過表達為出發點，借助RT-PCR和Northern blot等技術探究不依賴于啟動子轉錄和剪接現象，并對轉錄本的性質作深入分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 HEK 293T細胞和NIH 3T3細胞來自于ATCC。

1.1.2 主要試劑 pGEMT、pGL和pcDNA3.1載體分別購自Promega和Invitrogen生物公司。KOD-plus-突變試劑盒購自TOYOBO。細胞轉染試劑Lipofectamine LTX、RNA提取試劑Trizol、反轉錄試劑盒SuperScript III First-Strand Synthesis system、熒光定量PCR試劑盒SYBR Green以及ULTRAhyb-Oligo雜交液均購自Life Technologies。引物合成和測序委托金唯智生物公司。DMEM培養基、胎牛血清和抗生素為Gibco公司產品。所有酶制劑均來自于NEB。

1.2 方法

1.2.1 基因片段克隆 根據從NCBI網站獲得的不同基因片段序列信息以及文獻報道，設計不同的引物對直接以少量細胞為模板進行PCR擴增［15］。所用引物對分別為zkscan1：5′-AACCAGTCTACATCACAATGTCTAA-3′，5′-AACCTAGAAAAGACTGAT-GCTATAGT-3′；ZNF608：5′-AAATGGGCTTTGTGTGTG-3′，5′-TCCTGCCCTTACTCCTCT-3′；CAMSAP1：5′-CGTCTTTA-GTGGGACAGCCGTT-3′；5′-AGCCAGCAGATGGAGCACC-3′；HIPK3：5′-GAAAGTCATTAACTTGTCTTTGTAATAT-3′；5′-GACCTAAAGAGTCACGGGAGC-3′；clec2d：5′-AGCTATCATCAGATTCACACCTCA-3′；5′-TCACATGACACTGCCTTTCATC-3′。PCR反應條件均參照Q5 DNA聚合酶說明書進行。

1.2.2 載體構建 上述片段按照常規TA克隆方法得到pGEMT系列載體。對于插入到pcDNA3.1的序列片段，使用5′端加入酶切位點的引物對PCR得到，引物對分別為pCDNA3.1_zkscan1：5′-ACTGggtacc-AACCAGTCTACATCACAATGTCTAA-3′，5′-ACTGgcg gccgcAACCTAGAAAAGACTGATGCTATAGT-3′；400-1882：5′-ATCGgatatcAAAGTGCTGAGATTACAGGCGT-3′，5′-ATCGgcggccgcTAATTTTCATATTTTTAGTAGAGACAAGG-3′。Zkscan1突變按照KOD-plus-突變試劑盒的說明進行，使用的突變引物對為：5′-CAAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGG-3′和5′-CTCGTGACTGTAAGAGGC-3′。

1.2.3 細胞轉染、總RNA提取與反轉錄 細胞使用Lipofectamine LTX脂質體轉染試劑按常規方法轉染，轉染前細胞密度在70%左右，六孔板每孔轉染的質粒為2 μg。轉染24 h后，使用Trizol提取細胞總RNA，并使用DNase I處理去除殘留的基因組DNA。反轉錄按SuperScript III First-Strand Synthesis system試劑盒說明進行。RNA操作過程均在超凈臺中進行，并使用無RNase的儀器設備操作。

1.2.4 qRT-PCR和半定量RT-PCR qRT-PCR按SYBR Green的反應體系在Light Cycler480上進行，每個實驗3個重復，使用的引物對分別為GAPDH：5′-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′，5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′；zkscan1：5′-ATTCGTCTCGGAAACCCC-3′，5′-TCCCGTGATTCAGCAGTC-3′。半定量RT-PCR按照常規PCR反應進行，一般為22或24個循環取樣電泳，使用的引物對分別為GAPDH：5′-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，5′-TCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3′；zkscan1：5′-TCATGGACCTGAGATGCTCG-3′與5′-TACCATCCTTCTCCTGTGCA-3′或5′-AGTCCCACTTCAAACATTCGTCT-3′與 5′-CTGTTGTCCTGATAAATCAAGC-3′；ZNF608：5′-CGGTTGAACAGCTTTTGGTT-3′，5′-TGGATGAAGATGGGGAAAAG-3′；CAMSAP1：5′-TCAGTGCCTCGAAAGAACTTCCGT-3′，5′-TGTGCTCCTGCTCATACTGGTCAA-3′；HIPK3：5′-TATGTTGGTGGATCCTGTTCGGCA-3′，5′-TGGTGGGTAGACCAAGACTTGTGA-3′；clec2d：5′-CACCCTTGGAAGTGGACAGA-3′，5′-TGCTCTGACGACTCTCTGTG-3′；G3PDH：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.5 RNase R敏感性分析 典型的反應為20 μL總體系中加入2 μL RNase R 反應緩沖液、10 μg總RNA以及0.5 μL的RNase R，37℃反應2 h。對照組不加入RNase R，其他反應條件不變。反應結束后，取等體積（一般為1 μL）反應體系立刻進行RNA反轉錄和RT-PCR反應。通過分別比較實驗組和對照組中的GAPDH或靶基因的表達差異判斷其RNase R敏感性。

1.2.6 細胞藥物處理［10，16，17］將α-鵝膏蕈堿固體粉末溶于ddH2O中配置為1 mg/mL的母液，將ML-60218固定粉末溶于DMSO中配置為20 mmol/L母液；為了消除藥物對轉染效率的影響，待轉染過程完成6 h后（此時轉染基本結束），將細胞換到含不同濃度藥物的DMEM培養基繼續培養12 h。體積不足的部分加ddH2O或DMSO補齊。

1.2.7 RNase H處理 15 μg 細胞總RNA與1 μg寡核苷酸探針混合于16 μL體系中，70℃孵育1 min后立刻置于冰上1 min以上，然后再加入2 μL 10×RNase H緩沖液混勻后，37℃孵育10 min，最后加入2 μL RNase H（5 U/μL），37℃孵育30 min。

1.2.8 Northern Blot 通過甲醛變形瓊脂糖凝膠電泳分離細胞總RNA后轉印至尼龍膜，紫外交聯后使用標記好的放射性同位素雜交，通過ULTRAhyb-Oligo雜交液42℃預雜交30 min后加入標記好的放射性探針42℃雜交過夜。寡核苷酸探針的放射性標記總體系為20 μL，含2 μL32γ-ATP（10 mCi/mL），1 μL寡核苷酸（10 μmol/L），1 μL T4 PNK（10 U/μL），37度標記1 h。使用50 mL洗膜液（2×SSC，0.5% SDS）42℃洗膜2-3次，最后將尼龍膜取出后用濾紙干燥，用保鮮膜包住放入含磷屏的暗夾中曝光12-24 h，通過Typhoon scanner掃描磷屏信號。根據參考文獻［18］設計了合適的寡核苷酸探針，探針1：5′-GCGTTGGCGGAATATCTCTGGGTC-3′；探針 2：5′-TTTACTATTCCTCGTGACTG-3′；β-Actin：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

2 結果

2.1 外源DNA在哺乳動物細胞中不依賴于啟動子的轉錄和轉錄本剪接的現象

為了研究circRNA的生成機制，使用人zkscan1基因位置的環狀RNA作為研究對象。參與環化的外顯子以及其上下游約1 kb內含子序列克隆至真核表達載體pcDNA3.1中（pcDNA3.1_zkscan1，圖1-A）。將表達載體轉入293T細胞后，通過熒光定量PCR，可以檢測到豐富的反向剪接產物（圖1-B）。而在實驗偶然轉染的原核克隆中間載體（pGEMT_zkscan1）中也能檢測到同樣豐富的產物（圖1-B）。

為了排除可能存在的真核表達元件，將zkscan1序列區域以正向（pGEMT_zkscan1_F）或反向（pGEMT_zkscan1_R）插入pGEMT載體后轉入細胞，通過半定量RT-PCR均能檢測到“反向剪接產物”（圖1-C）。為了進一步排除載體骨架序列的影響，只將覆蓋zkscan1區域的PCR片段轉染入細胞后的結果（圖1-C）顯示，豐富的轉錄產物依然能被檢測到，說明載體序列不參與轉錄。

為了進一步驗證這些產物是否具有環狀構型，通過RNase R（僅能降解線性RNA而不能降解環狀RNA的外切酶）處理轉染不同質粒細胞的總RNA后進行半定量RT-PCR（圖1-D）發現，轉染了pcDNA3.1_zkscan1質粒細胞中的反向剪接產物幾乎不受RNase R的影響，符合預期，而轉染了pGEMT_zkscan1載體細胞中的反向剪接產物幾乎完全被降解，說明后者表達的大部分產物可能沒有環狀構型。在本研究中，為了區別其與環狀RNA的反向剪接方式，稱這種特殊的剪接為“異常剪接”。

2.2 通過Northern blot分析不依賴于啟動子的轉錄產物

為了進一步分析這些異常剪接產物，使用了兩個探針做Northern blot，探針1識別外顯子2，探針2設計在跨反向剪接位點上，前者能檢測到含有外顯子2的所有RNA分子，包括線性mRNA分子和環狀RNA，而后者只能檢測到由外顯子反向剪接產生的環狀RNA（圖2-A）。Northern blot結果（圖2-B）顯示，空載體不表達任何RNA分子，正對照400-1 882表達3種RNA分子。實驗組中只有轉染了pcDNA3.1_zkscan1質粒的細胞才能檢測到相應的RNA分子，而轉染了pGEMT_zkscan1或zkscan1 PCR擴增產物的組均不能檢測到明顯的條帶。推測這些特殊的RNA分子可能具有很長的分子結構，因此在瓊脂糖凝膠中積在膠孔附近難以轉膜。

圖1 外源zkscan1基因片段能進行不依賴于啟動子的異常轉錄

當用探針1和RNase H水解轉染了zkscan1 PCR擴增產物后的細胞總RNA后，以探針2進行Northern blot雜交可以檢測到明顯的條帶，而探針1檢測不到信號，反之亦然（圖2-C）。這些結果表明，這些異常的轉錄產物確實存在，而且極有可能具有串聯重復的長分子結構。

2.3 異常轉錄本的剪接依賴于細胞內源的剪接信號

通過RT-PCR實驗分析轉染了pcDNA3.1_zkscan1、pGEMT_zkscan1及zkscan1 PCR擴增產物的細胞總RNA發現，它們存在相同的擴增圖譜，共產生3種剪接產物（圖4-A，WT）。而將下游內含子剪接位點的GU突變為CA后，均發現了同樣的剪接條帶的上移（圖4-A，Mut）。Sanger測序顯示，這些不同條帶的產物均符合“GU-AG”法則，說明異常轉錄本的產生也是利用了同樣的細胞內源剪接信號（圖4-B）。

2.4 RNA聚合酶II參與異常轉錄

利用真核生物RNA聚合酶對α- 鵝膏蕈堿和ML-60218的敏感性，研究這種不依賴于啟動子的特殊轉錄是由哪一種RNA聚合酶負責合成。真核生物RNA聚合酶II對α-鵝膏蕈堿高度敏感，是RNA聚合酶III的敏感性的100倍。ML-60218是RNA聚合酶III的特異性抑制劑，抑制能力IC50為27 μmol/L，對其他兩種酶沒有抑制作用。如圖4-A顯示，當α-鵝膏蕈堿的濃度為1 μg/mL時，只抑制RNA聚合酶II，幾乎不抑制RNA聚合酶III，不依賴于啟動子的轉錄（pGEMT_zkscan1_異常剪接）被很大程度抑制，而且這種抑制效應等同于RNA聚合酶II類型的啟動子CMV起始的轉錄反應（pcDNA_zkscan1_反向剪接）。與α-鵝膏蕈堿的有效抑制作用不同，高濃度的ML-60218（＞ 2倍IC50）則對兩種轉錄都沒有明顯的抑制作用（圖4-B）。推測RNA聚合酶II極有可能負責這種不依賴于啟動子的轉錄。

2.5 不依賴于啟動子的DNA轉錄和剪接在哺乳動物細胞中是保守的

圖2 Northern blotting鑒定不同的轉錄產物

圖3 轉染不同質粒后對應的反向/異常剪接產物的剪接模式

為了驗證這種不依賴于啟動子的DNA轉錄和剪接的保守性，從人基因組中克隆了產生環狀RNA的外顯子DNA區段以及其上下游部分內含子序列（ZNF608，CAMSAP1，HIPK3）。分別在不同的PCR循環數時取5 μL RT-PCR產物進行電泳分析。和內源反向剪接產物需要在30-35個PCR循環數時出現擴增條帶相比，轉染外源DNA的異常剪接產物均能在18-22個PCR循環數時出現擴增條帶（圖5-A），說明它們均高效表達。

圖 4 RNA聚合酶II負責不依賴于啟動子的轉錄

當將pcDNA3.1_zkscan1和pGEMT_zkscan1載體導入小鼠NIH 3T3細胞后，半定量RT-PCR結果顯示前者的反向剪接以及后者的異常剪接現象均能觀察到。當將一段小鼠基因片段（clec2d）按同樣的方法克隆轉入人293T細胞后，也能觀察到小鼠基因在人細胞中的異常剪接現象。這些結果表明哺乳動物細胞中不依賴于啟動子的DNA轉錄和剪接是保守的。

圖5 不依賴啟動子的轉錄與剪接沒有序列選擇性

3 討論

本研究證實了含外顯子的雙鏈DNA分子導入哺乳動物細胞后能被RNA聚合酶識別和有效轉錄。由于轉染的外源DNA分子整合到宿主基因組的概率極低（千分之一或更低），這些異常轉錄本很可能是來源于游離于染色體外的DNA分子的轉錄［5］。根據RNA聚合酶的抑制性實驗結果，推測RNA聚合酶II很有可能參與這種異常的轉錄。一般情況下，RNA聚合酶II通過識別特殊的啟動子區域進行下游DNA的轉錄。根據報道，細胞內源的基因組DNA大多以染色質形式存在，經過復雜的DNA修飾或結合多種組蛋白［19，20］。而導入細胞的雙鏈DNA是提取自原核生物的質粒或通過PCR擴增的片段，均處于裸露狀態，RNA聚合酶更容易結合。本研究的發現證明，細胞從外源獲取的DNA分子除了通過水平基因轉移對宿主細胞產生影響，還有可能在RNA水平對宿主細胞產生更直接的影響。

同時，本研究還對環狀RNA的表達分析有重要發現，即通過反向引物對進行RT-PCR檢測到的分子并不一定是以環狀構型存在，還需要進行RNase R的進一步驗證。

4 結論

本研究使用真核表達載體構建了環狀RNA的表達體系，并發現了外源DNA在哺乳動物細胞中不依賴于啟動子的轉錄和轉錄本的剪接現象；證明了這種現象在哺乳動物細胞中是保守的。該研究對環狀RNA的表達分析具有重要的借鑒作用。

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（責任編輯 李楠）

Promoter-independent Transcription of Exogenous DNA and Subsequent RNA Splicing in Mammalian Cells

XU Wen1YANG Hua-yu2ZHENG Yong-chang2
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084；2. Department of Liver Surgery，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730）

Introduction of exogenous double stranded DNA into mammalian cells will undergo restructuring，rearrangement and other complex molecular and biochemical reaction. Few DNA molecules will randomly integrate into the host genome，namely the occurrence of horizontal gene transfer. However，it is unclear whether these exogenous DNA molecules can be recognized by cell machine and triggers the transcription in the circumstance of containing no special promoter. During the construction of circle RNA（circRNA）expression system，we discovered that promoter-independent transcription of exogenous DNA occurred，also RNA splicing was in accord with “GU-AG” in transcripts，and subsequently abnormal spliced molecules similar to the circRNA formed. Further studies showed that the promoter-independent transcription and splicing of exogenous DNA in mammalian cells were conservative. Conclusively，this work revealed a new destiny approach of exogenous DNA in the mammalian cells，which is of significance and applicability in studying the effects of exogenous DNA on host cells.

promoter-independent transcription；RNA splicing；circRNA；DNA transfection；alternative splicing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0183

2017-03-10

國家高技術研究發展計劃（2015AA020303）

徐文，男，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：xuwenhbnu@163.com

鄭永昌，男，副主任醫師，研究方向：肝膽腫瘤分子生物學；E-mail：zyc_pumc@163.com