正交設計優化綠竹ISSR-PCR體系和引物篩選

徐雯瞿印權韓笑何天友榮俊冬鄭郁善

（1. 福建農林大學林學院，福州 350002；2. 福建農林大學藝術學院園林學院，福州 350002）

正交設計優化綠竹ISSR-PCR體系和引物篩選

徐雯1瞿印權1韓笑1何天友2榮俊冬1鄭郁善1

（1. 福建農林大學林學院，福州 350002；2. 福建農林大學藝術學院園林學院，福州 350002）

旨在建立綠竹ISSR-PCR最佳反應體系和擴增程序，并篩選適于綠竹ISSR-PCR分析的高多態性引物。以綠竹基因組DNA為ISSR-PCR擴增模板，采用正交試驗方法，對dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、模板DNA用量設計5因素4水平試驗，采用極差分析法和方差分析法對試驗結果進行分析。并對退火溫度和循環次數進行篩選，建立綠竹ISSR-PCR最佳反應體系和擴增程序。并利用優化后的體系對100條ISSR引物進行篩選。最終確定的最佳反應體系為：20 μL的擴增體系中，dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA濃度為60 ng，10×PCR Buffer體積為2 μL、剩下用滅菌ddH2O補全。各因素影響大小依次是：Mg2+＞ dNTPs ＞模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶＞引物。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，（根據引物的退火溫度）復性30 s，72℃延伸90 s，循環38次，72℃延伸10 min，4℃保存。以此體系為基礎進行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態性較高、重復性好的引物。

綠竹；ISSR；正交試驗設計；反應體系；擴增程序；引物篩選

綠竹（Dendrocalamopsis oldhami（Munro））屬禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）綠竹屬（Dendrocalamopsis）叢生竹種，是綠竹屬中分布最廣、栽培最多的竹種［1］。綠竹具有發筍期長、生長迅速、產量豐富、筍味鮮美，質地柔軟的優點，是我國南方優良速生的筍材兩用叢生竹種之一，具有較高的商品效益，是主產地的經濟來源之一［2］。綠竹原產我國臺灣省淡水，我國主要分布在浙江南部、福建、臺灣、廣東、廣西和海南等省區［3］。

目前，國內關于綠竹的研究報道，主要集中在良種繁育技術研究、生物量研究、生理特性研究，蛋白組學研究等方面［4-10］，而關于分子遺傳學研究［11-13］較少，且綠竹分子標記的研究中主要是運用隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術，余學軍等［11］利用RAPD標記對22個不同栽培類型的綠竹進行多態性分析。吳益民等［12］構建孝順竹、鳳尾竹、綠竹、白綠竹4個竹種RAPD指紋圖譜。但是RAPD在實驗過程中容易產生假帶、共遷移等現象，所以結果不夠穩定，重復性較低。簡單重復序列區間（Inter simpce sequence repeat，ISSR）技術是1994年Zietkiewicz等［14］在簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標記技術的基礎上發展起來的一種新的分子標記方法，具有簡單快捷易操作，DNA用量較少，試驗成本低等優點，由于其多態性好、穩定性高和重復性高的特性被廣泛應用于多種物種的品種鑒定和遺傳多樣性分析等方面［15，16］。而利用ISSR分子標記技術對綠竹ISSR-PCR體系建立尚未有報道。本實驗采用正交試驗設計的方法對dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA濃度設計5因素4水平試驗，建立綠竹ISSR-PCR最佳反應體系，并優化擴增程序、篩選出高多態性引物，旨在為綠竹的種質資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、分子育種、DNA指紋圖譜構建等研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的材料于2016年8月采自于福建省東山國有赤山林場的綠竹地理種源試驗樣地。對不同的植株隨機選取3-5片嫩葉，放置于塑料自封袋中，并用變色硅膠進行迅速干燥，將干燥的材料速帶回實驗室，于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 綠竹基因組總DNA的提取與檢測 綠竹總DNA的提取采用的是杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（Cat＃BSC13S1）法，并對該種方法略作改良。提取完后用微量紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性與清晰性，看是否有降解或斷裂現象，將滿足試驗條件的DNA稀釋到20 ng/μL，并置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 綠竹ISSR-PCR擴增反應體系的優化 用L16（45）正交試驗設計方法對dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA濃度設計5因素4水平試驗（表1），共16個處理，每個處理2個重復，來研究各因素對ISSR-PCR擴增的影響。反應體系的總體積為20 μL，引物選擇UBC815。擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，（根據引物的退火溫度）復性30 s，72℃延伸90 s，循環35次，72℃延伸10 min，4℃保存。

將PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠上，電泳45 min，電壓設為5 v/cm。并用紫外凝膠成像分析儀拍照記錄電泳情況。利用直觀分析法對每個處理結果進行評分，一共劃分為16個等級，以條帶的清晰度、明亮度、特異性高低為評分標準，最高的記為16分，最低的記為1分［17］。評分結果用DPS7.05統計軟件進行方差分析。

1.2.3 綠竹ISSR-PCR擴增反應程序的優化 在最優反應體系的基礎上，采用單因素試驗的方法對退火溫度和循環次數進行篩選，根據引物U815的Tm值52.9℃，在45-60℃之間設置了12個溫度梯度，系統自動生成的12個溫度梯度分別為44.9℃，45.2℃，46.1℃，47.5℃，49.3℃，51.2℃，53.3℃，55.2℃，57.1℃，58.5℃，59.6℃，60.1℃。對循環次數設置了30次、32次、35次、38次、40次5個梯度，以篩選出最佳的ISSR-PCR擴增反應程序。

1.2.4 綠竹ISSR擴增體系穩定性驗證 以不同種源的綠竹的基因組總DNA為模板，在最佳反應體系和最佳擴增程序下，用引物 UBC815進行ISSR-PCR擴增，檢驗建立的擴增體系的穩定性。

1.2.5 ISSR有效引物的篩選 以優化的反應體系及擴增程序體系為基礎進行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴增條帶清晰、多態性較高、重復性好的引物。

表1 ISSR-PCR反應的因素水平L16（45）正交試驗設計

2 結果

2.1 綠竹基因組總DNA的提取結果

部分綠竹基因組總DNA凝膠電泳結果如圖1所示，我們可以看出DNA條帶清晰明亮，無明顯拖尾現象，說明所提取的DNA基因組完整性較好，無明顯降解現象。利用微量紫外分光光度計測定DNA的A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說明DNA的純度較高。

圖1 綠竹基因組DNA電泳圖

2.2 綠竹ISSR-PCR正交試驗結果

綠竹正交試驗的電泳結果如圖2所示，在16個處理組合中，由于dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA濃度5個影響因素各水平組合的不同，擴增結果存在明顯的差異。對正交試驗的各處理的擴增結果進行評分，評分結果見表1。根據評分計算每個因素同一水平下的總和T和平均值X，以及極差R，計算結果見表2。

極差R值越大，說明該因素對綠竹ISSR-PCR擴增的影響越大。由表2可知，各因素對ISSR-PCR擴增結果的影響從大到小依次為：Mg2+＞ dNTPs ＞ 模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶 ＞ 引物。平均值X最大值所對應的水平即為該因素的最佳濃度。所以dNTPs水平3、Mg2+水平1、Taq DNA聚合酶水平3、引物水平2、模板DNA水平4最好。因此綠竹ISSR-PCR正交試驗得出的最佳水平為：dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.5 μmol/L，DNA濃度為為60 ng。

為了進一步判斷各個因素對綠竹ISSR-PCR擴增影響的顯著程度，對正交試驗的結果進行方差分析，結果見表3。其中F值越大，說明該因素對綠竹ISSR-PCR擴增的影響越大。由表3可知，各因素對ISSR-PCR擴增結果的影響從大到小依次為：Mg2+＞ dNTPs ＞模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶＞引物。與極差分析的結果一致。其中dNTPs、Mg2+和模板DNA對綠竹ISSR-PCR擴增影響達到極顯著的水平（P＜0.01）。Taq DNA聚合酶對綠竹ISSR-PCR擴增影響達到顯著的水平（P＜0.05）。引物濃度對綠竹ISSR-PCR擴增影響不顯著。

為了進一步確定每個因素的最適宜的濃度水平，對5個因素進行Duncan多重比較，結果見表4。由之前的極差分析和方差分析可知，dNTPs對綠竹ISSR-PCR擴增的影響僅次于Mg2+，從多重比較可以看出，dNTPs水平1、水平2、水平3和水平4差異顯著，而水平1、水平2、水平3之間的差異并不顯著，從經濟角度最終選擇dNTPs最佳濃度為0.2 mmol/L。Mg2+對綠竹ISSR-PCR擴增的影響最大，Mg2+水平1、水平2和水平3、水平4差異顯著，水平1和水平2兩者差異不顯著，綜合而言，最終選擇Mg2+最佳濃度為2.0 mmol/L。當TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U時，極差分析的均值最大，且與其他3個水平差異顯著，所以最終選擇TaqDNA聚合酶最佳濃度為1.5 U。在本試驗中，引物濃度對綠竹ISSR-PCR擴增的影響最小，且4個水平間差異不顯著，從經濟角度最終選擇引物最佳濃度為0.4 μmol/L。當模板DNA濃度為60 ng，極差分析的均值最大，且與其他3個水平差異顯著，所以最終選模板DNA最佳用量為60 ng。

綜上所述，最終確定的綠竹ISSR-PCR擴增最佳反應體積為：dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA濃度為60 ng。

圖2 正交設計ISSR-PCR 反應體系擴增結果

表2 正交試驗極差分析結果

表3 ISSR-PCR反應各因素方差分析

表4 ISSR-PCR各因素水平間Duncan多重比較

圖3 循環次數對ISSR-PCR的影響

圖4 退火溫度對ISSR-PCR的影響

2.3 綠竹ISSR-PCR擴增反應程序的優化結果

不同的循環次數對ISSR-PCR擴增有一定的影響。本實驗對循環次數設置了30次、32次、35次、38次和40次5個梯度，實驗結果如圖3所示。當循環次數為38次時，擴增條帶最為清晰明亮且穩定。所以，選擇38次循環為ISSR-PCR反應的最佳循環次數。

不同的退火溫度對ISSR-PCR擴增也有一定的影響。根據引物U815的Tm值52.9℃，在45-60℃之間設置了12個溫度梯度，結果（圖4）顯示退火溫度對擴增影響明顯，當退火溫度為47.5℃時，擴增的條帶數最為清晰穩定，當退火溫度大于47.5℃時，高分子量區域和中等分子量區域條帶的擴增效率下降，直至無擴增條帶，且在低分子量區域也逐漸出現彌散現象，整體電泳條帶數逐漸減少，清晰度也逐漸減弱，因此，最終確定引物U815的最佳退火溫度為47.5℃。

2.4 綠竹ISSR擴增體系穩定性驗證

利用引物UBC818對不同種源的綠竹個體的基因組總DNA樣品進行進行ISSR-PCR擴增，擴增結果見圖5。由圖5可知，在該體系下均能擴增出條帶清晰、穩定，多態性豐富的條帶。說明該體系穩定可靠，適合綠竹ISSR-PCR擴增反應。

圖5 不同種源的綠竹個體擴增結果

圖6 ISSR有效引物的篩選

表5 供篩選引物序列及擴增條帶數

2.5 ISSR有效引物的篩選

根據綠竹優化后的最佳反應體系和擴增程序，對100條隨機引物進行擴增。部分引物篩選結果如圖6所示。結果顯示利用建立的體系篩選不同的引物時，大部分引物都能擴增出清晰明亮的條帶，只有少部分引物擴增出的條帶數較少或不能擴增出條帶。說明本實驗建立的綠竹最佳反應體系具有較高的重復性和穩定性。最終在100條引物中篩選出14條擴增條帶清晰不拖尾，穩定性較好的引物（表5）。

3 討論

ISSR分子標記技術已經廣泛應用于種質資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、指紋圖譜的構建等方面的研究，是目前使用最廣泛的分子標記技術之一［18-20］。ISSR-PCR擴增結果受到物種類型、反應體系、擴增程序、引物等的綜合影響。本試驗采用正交試驗設計的方法對dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度、模板DNA用量設計5因素4水平試驗，并對擴增程序進行優化，利用優化后的體系對100條ISSR引物進行篩選。正交試驗設計可以克服單因素試驗不能考慮到各影響因素之間的相互作用的缺點，還可以解決完全組合設計需要大量試驗、耗時耗費的不足，具有設計均衡分散、齊整可比、效應明顯、節約時間和成本等優點［17］，能夠通過較少的處理組合快速找到最佳的ISSR-PCR反應體系，并能分析出不同因素對擴增結果影響的顯著性。但是正交試驗直觀分析又有一定的主觀隨機性，所以需要設置重復試驗來減少打分誤差，增加數據的可靠性［21］。

在本實驗中，不同的處理組合對綠竹ISSR-PCR擴增結果的影響差異明顯。極差分析和方差分析的結果均表明各因素對綠竹ISSR-PCR擴增結果的影響從大到小依次為：Mg2+＞ dNTPs ＞模板DNA ＞ Taq DNA聚合酶＞引物。Mg2+是影響綠竹ISSR-PCR擴增最顯著的因素，Mg2+濃度變化直接影響Taq DNA聚合酶的活性，并間接影響引物與模板DNA的雙聯雜交體的解鏈溫度、引物的退火溫度、擴增產物的特異性以及引物二聚體的生成［22-23］。靳曉麗等［24-26］研究均顯示Mg2+對ISSR-PCR擴增影響最大，所以正確的把握好Mg2+的用量很關鍵。dNTPs對綠竹ISSR-PCR擴增的影響僅次于Mg2+，dNTPs是PCR擴增的底物，dNTPs濃度過低會降低DNA的合成速率，導致擴增產量的下降；dNTPs濃度過高又會與Mg2+相鰲合從而間接影響Taq DNA聚合酶的活性，導致堿基的錯誤滲入和非特異性擴增［27，28］。模板DNA濃度對綠竹ISSR-PCR擴增的影響也是極顯著的，在本實驗中DNA模板濃度越高，擴增的條帶越亮產量越多。Taq DNA聚合酶對綠竹ISSR-PCR擴增的影響是顯著的，Taq DNA聚合酶濃度過低會導致擴增效率較低，條帶較弱；濃度過高又會產生非特異性條帶［29］。在本實驗中引物濃度對綠竹ISSRPCR擴增的影響不顯著，這可能與本實驗中引物濃度設置的水平范圍有關，在本實驗中，引物濃度在0.4-0.7 μmol/L之間設置了4個水平，4個水平間差異不顯著，與包蕊等［30］研究的在ISSR-PCR反應中引物濃度影響最小的研究結果一致。

循環次數和退火溫度對綠竹ISSR-PCR 擴增也有一定影響，循環次數較少，擴增的條帶數也較少且清晰度較低；循環次數過多又會增加非特異性擴增。退火溫度較低會導致模板DNA與引物的非特異性結合且背景深；退火溫度較高又會使得模板DNA與引物的結合率下降，從而使得擴增出來的條帶數較少［31］。在一定的溫度范圍內，隨著退火溫度的增加，擴增出的產物的特異性越好，一般最佳的退火溫度低于引物的真實Tm值5℃左右［32］。

4 結論

本研究采用L16（45）正交試驗設計方法對dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶濃度、引物濃度和模板DNA濃度設計5因素4水平試驗，并通過直觀分析和正交極差分析對比，確定了這5個因素對ISSR-PCR擴增的影響力大小以及最佳用量。最后確定適合綠竹ISSR-PCR的最佳反應體系為：dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為1.5 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA濃度為60 ng。驗證實驗表明，該體系穩定可靠，適合于綠竹ISSR-PCR擴增。

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（責任編輯 李楠）

Optimization of ISSR-PCR Reaction System on Dendrocalamus oldhami by Orthogonal Design，and Selection of Primer

XU Wen1QU Yin-quan1HAN Xiao1HE Tian-you2RONG Jun-dong1ZHENG Yu-shan1
（1. College of forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002；2. College of Art & Landscape Architecture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）

This work is to establish the optimal ISSR-PCR reaction system and amplifying procedure，and to screen high polymorphism primers for ISSR-PCR analysis of Dendrocalamus oldhami（Munro）. First，the genomic DNA extracted from D. oldhami（Munro）was used as template for ISSR-PCR amplification，and the orthogonal design（L16（45））was to investigate the optimal concentrations of dNTPs，Mg2+，Taq DNA polymerase，primers and DNA template，and the results were analyzed by range and variance analysis method. Then，the annealing temperature and the number of cycles were screened for establishing the optimal D. oldhami（Munro）ISSR-PCR reaction system and amplifying procedure. Moreover，the optimized system was utilized to screen the 100 ISSR primers. Ultimately，the optimal reaction system was determined as follows：in 20 μL reaction system containing 0.2 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L Mg2+，1.5U Taq DNA polymerase，0.4 μmol/ L primer，60 ng DNA template，2.0 μL 10×Taq Buffer，and ddH2O completed. The order of the effect by the factors was in Mg2+＞ dNTPs ＞DNA template ＞ Taq DNA polymerase ＞ primer. The optimal amplifying procedure was as follows：pre-denaturing for 5 min at 94℃，38 cycles were performed with denaturing of 45 s at 94℃，annealing of 30 s due to denaturing temperature of different primer，extension of 90 s at 72℃，a final extension step of 10 min at 72℃ and stored at 4℃. Using this optimized PCR system，14 of 100 primers was selected for their clarity，high polymorphism and repetition.

Dendrocalamus oldhami（Munro）；ISSR；orthogonal design；reaction system；amplifying procedure；primer screening

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170004

2017-01-11

福建省農業科技重點項目（2013N0002），福建省農業科技重大項目（2011N5002）

徐雯，女，碩士研究生，研究方向：森林培育理論與技術；E-mail：1243051350@qq.com

鄭郁善，男，教授，博導，研究方向：森林培育與園林植物栽培；E-mail：zys1960@ 163.com