新疆辣椒CMV基因組序列分析與CP基因多克隆抗體制備

周東 劉貞 劉麗 許鵬程 鄭銀英

（石河子大學生命科學學院 石河子大學農業生物技術重點實驗室，石河子 832003）

新疆辣椒CMV基因組序列分析與CP基因多克隆抗體制備

周東 劉貞 劉麗 許鵬程 鄭銀英

（石河子大學生命科學學院 石河子大學農業生物技術重點實驗室，石河子 832003）

克隆新疆辣椒LJ-10 CMV基因組片段，并進行序列分析，構建CMV CP基因的原核表達載體，并制備CP基因的多克隆抗體。利用RT-PCR技術，克隆新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1（3 357 nt）、RNA2（3 042 nt），RNA3（2 212 nt）全基因組片段，與GenBank上登陸的CMV亞組IA、亞組IB、亞組Ⅱ分離物進行序列分析和系統進化樹分析。將LJ-10 CMV CP基因克隆到原核表達載體pET-22b中，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達純化，以純化的重組蛋白為抗原免疫兔子，制備CMV特異性抗血清，并進行間接ELISA和Western blotting分析。結果顯示，成功克隆了新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1、RNA2、RNA3全基因組片段，序列分析及系統進化樹分析表明，該分離物屬于CMV亞組IB。成功構建了LJ-10 CMV CP基因的原核表達載體pET-CMV-CP，在大腸桿菌BL21（DE3）中經IPTG誘導獲得了與預期大小一致的分子量約為27 kD的重組蛋白，制備了CMV的特異性抗血清。間接ELISA和Western blotting分析表明，制備的抗血清效價為1：500-1 000。新疆辣椒LJ-10 CMV分離物屬于CMV亞組IB，成功構建了LJ-10 CMV CP基因的原核表達載體，制備了相應的多克隆抗體。

黃瓜花葉病毒；序列分析；外殼蛋白；原核表達；蛋白質印跡檢測

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是目前發現的寄主范圍和分布最廣、危害最嚴重的病毒之一，能侵染85科365屬1 000多種植物［1］，通過蚜蟲、種子、菟絲子和汁液摩擦接種等多種途徑傳播［2］。

CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員，基因組為三分體單鏈正義RNA［1］。RNA1編碼1a蛋白；RNA2編碼2a蛋白，其亞基因組RNA4A 編碼病毒沉默抑制子2b 蛋白［3，4］，1a和2a蛋白均參與病毒的復制［5，6］；RNA3編碼3a移動蛋白（Movement protein，MP），參與病毒移動［7，8］，其亞基因組RNA4編碼外殼蛋白（Coat protein，CP），決定病毒粒子的移動及病毒的蚜傳活性［9，10］。CMV依據基因組RNA3的5′端非編碼區和CP基因序列，劃分為CMV I和CMV II組［1］。CMV I進一步劃分為CMV IA和CMV IB亞組，其亞組間核苷酸序列相似性為92%-95%［11］。有些CMV還攜帶基因組大小為332-405 nt單鏈、線狀衛星RNA（Satellite RNA，satRNA）［12］。

CMV在我國新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等蔬菜中均有發生，且不同寄主的CMV均歸為CMV IB亞組，然而辣椒的CMV在血清學和CP序列中存在較大的變異［13-15］。目前，不同地域的西番蓮、加工番茄、煙草等植物中的CMV分離物的CP基因通過原核表達，制備了高特異性抗體，從而為快速地檢測不同地域、不同寄主中的CMV奠定了基礎［16，17］。因此本研究從感染CMV的辣椒中提取dsRNA，利用RT-PCR技術克隆了RNA1、RNA2、RNA3全基因組片段，并通過原核表達CP基因制備基因工程多克隆抗體，以期為我國新疆CMV高效、快速血清學檢測提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年從石河子蔬菜研究所采集感染CMV，編號為LJ-10辣椒樣本提取dsRNA［18］。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3），原核表達載體pET-22b為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據GenBank登錄CMV株系或分離物序列設計引物，由上海生工生物技術有限公司合成（表1）。

表1 擴增CMV RNA1、RNA2、RNA3的RT-PCR引物

1.2.2 CMV基因組RT-PCR擴增 從LJ-10樣本上提取的dsRNA為模板逆轉錄合成cDNA，具體反應體系為：dsRNA 3 μL、隨機引物2 μL、DEPC-H2O 5 μL混勻，95℃ 10 min，立即冰浴 2-5 min。繼續加入5 μL 5 × AMV buffer、0.3 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、0.7 μL AMV（10 U/μL）、3 μL 2.5 mmol/L dNTPs、6 μL DEPC-H2O， 為25 μL體系。 混勻，42℃ 60 min，最后70℃ 15 min，-20℃保存備用。

以cDNA為模板進行PCR擴增，回收、純化預期大小的PCR產物后，連接至pGEM-T Easy載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，在LB（含 50 μg/L氨芐青霉素）培養基上37℃培養14-16 h，挑取單菌落，提取質粒DNA，酶切鑒定重組質粒正確后，由上海英駿生物技術有限公司北京測序部公司進行序列測定。

1.2.3 序列分析 用DNASTAR軟件進行序列相似性比較，用遺傳進化分析軟件MEGA5.0鄰接法（Neighbor- Joining）計算序列間的遺傳距離。Bootstrap為1 000重抽樣統計評價各枝的置信度，同時，進化樹構建中引入花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）ER（U15730）株系為外群。所用分離物如下：CMV亞組IA：Fny（D00356、D00355、D10538）；Leg（D16403、D16406、D16405）；Mf（AJ276479、AJ276480、AJ276481）；Y（D12537、D12538、D12499）；O（*、D10209、D00385）。CMV亞組IB：Nt9（D28778、D28779、D28780）；Tfn（Y16924、Y16925、Y16926）；IX（U20220、U20218、U20219）；SD（AF071551、D86330、AB008777）；IA（AB042292、AB042293、AB042294）；Phy（DQ402477、DQ412731、DQ412732）。CMV亞 組II：Q（X02733、X00985、M21464）；Ly（AF198101、AF198102、AF198103）；S（Y10884、Y10885、U37227、AF063610）；LS（AF416899、AF416900、AF127976）；Trk7（AJ007933、AJ007934、L15336）。1.2.4 原核表達蛋白純化與多克隆抗體制備 根據辣椒上獲得的CMV RNA3 序列設計合成CMV S/CMV A引物，擴增CP基因，之后利用Noc I/BamH I雙酶切，將LJ-10 CP基因重組到原核表達載體pET-22b，構建重組質粒pET-CMV CP，轉化E. coli BL21（DE3）感受態細胞，以空載體pET-22b為對照，37℃ 1 mmol/L IPTG誘導2-6 h，經SDS-PAGE檢測蛋白表達。按照Novagen公司的Ni NTA His-bind resin親和柱洗脫目的蛋白，生理鹽水透析，冷凍干燥。將純化后的抗原按照常規方法免疫4只4個月大、2.1 kg健康新西蘭雄性大白兔，免疫4次后取抗原，親和純化分離血清，-20℃保存。

1.2.5 多克隆抗體效價測定與Western-blot分析 取0.1 g 樣本新鮮嫩葉加入10×體積的緩沖液（PBST + 2% PVP）充分研磨，離心后的上清為抗原，以制備的CMV多克隆抗體為一抗，堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG為二抗，進行間接ELISA，用酶標儀在波長為405 nm 處讀取吸光度值，P/N≥2視為陽性樣品。

為進一步驗證所制備的CMV抗體的有效效價，以本文制備的CMV CP基因的多克隆抗體為第一抗體，堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG為第二抗體，以NBT和BCIP為顯色底物，取0.1 g已用間接ELISA方法檢測含有CMV病毒的植株葉片，用液氮充分研磨，加10×總蛋白提取液（0.5 mol/L Tris-HCl pH8.0+4% β-巰基乙醇+ 40%蔗糖+0.2% SDS）充分混勻，冰浴30 min，4℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清，用于蛋白質印跡檢測。

2 結果

2.1 CMV基因組結構分析

以從辣椒上提取的dsRNA為模板，利用RTPCR和TA克隆技術獲得辣椒LJ-10的CMV全基因組序列。其中RNA1 長3 357 nt，內含1a ORF（97-3 075，2 979 nt），推導編碼993 aa的1a蛋白；RNA2長3 042 nt，內含2a ORF（76-2 649，2 574 nt）和2b ORF（2 411-2 743，333 nt），分別推導編碼858 aa 的2a蛋白和111 aa的2b蛋白；RNA3 長2 212 nt，內含3a ORF（122-958，837 nt）和CP ORF（1 257-1 910，654 nt），分別推導編碼279 aa 的3a蛋白和218 aa 的CP蛋白。

2.2 CMV基因組序列分析

CMV LJ-10基因組序列與GenBank上登陸的CMV亞組IA、亞組IB、亞組II不同分離物構建系統進化樹。RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a、CP系統進化樹和序列相似性分析結果（圖1）顯示，LJ-10屬于CMV亞組IB。

進一步將CMV LJ-10與CMV亞組IB 6個分離物進行序列比較發現，LJ-10 RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a與SD（中國，煙草）分離物序列相似性較高（表2），親緣關系較近在系統進化樹上處于一個分支（圖1-A、B、C、D）。

LJ-10、IA（日本，未知）、IX（美國，番茄）3個分離物的 CP核苷酸序列相似性較低，為92.2%-93.3%；與其他SD、Phy（中國大陸，不詳）、Nt9（中國臺灣，不詳）、Tfn（意大利，番茄）4個分離物的相似性也較低，為92.7%-93.9%；SD、Phy、Nt9、Tfn 4個分離物間相似性較高，為94.7%-99.7%（表2）。以CP核苷酸序列構建的系統進化樹上LJ-10與SD分離物的親緣關系較遠，與IX、IA親緣關系較近處于一個分支（圖1-E）。

圖1 CMV 1a（A）、2a（B）、2b（C）、3a（D）和CP（E）核苷酸序列系統進化樹

CMV LJ-10的 1a、2a、2b、3a、CP氨基酸序列比對與系統進化樹分析結果與核苷酸序列分析結果基本一致。

表2 CMV-LJ-10與亞組IB分離物的基因組RNA及推導的氨基酸序列比對

2.3 CMV CP原核表達蛋白的多克隆抗體制備

構建重組質粒pET-CMV CP 37℃ 1 mmol/L IPTG誘導2-6 h獲得分子量約為27 kD與預期目的大小一致的重組表達蛋白（圖2）。CMV CP蛋白長218 aa，推導編碼大小約24 kD蛋白質，本文使用Noc I/Bam HI雙酶切將CMV CP基因構建至原核表達載體pET-22b，獲得重組質粒pET-CMV CP。即CMV CP蛋白融合pET22b載體 C端含6個His標簽的21 aa，所以實際表達蛋白大小約為27 kD。

將CMV CP原核表達重組蛋白純化后免疫兔子制備多克隆抗體。以未免疫的兔血清為對照，采用常規間接ELASA法測定，制備的抗血清可與0.2 μg/孔純化抗原有很強的特異反應。

2.4 CMV多克隆抗體的效價分析

2015年7-8月，從石河子蔬菜花卉研究所和石河子大學北區試驗田采集辣椒和加工番茄樣本，以本實驗制備的CMV抗體為一抗，間接ELISA可有效檢出CMV，辣椒和加工番茄上CMV的檢出率分別為54.1%（13/24）和60%（6/10）。

為了進一步驗證ELISA實驗結果的準確性，將ELISA檢測為陽性的辣椒和加工番茄樣品提取的總蛋白為抗原，進行Western-blot檢測，結果同樣顯示與預期大小一致的大小約24 kD蛋白質（圖3和圖4）。間接ELISA和Western blot分析結果顯示，本文制備的CMV抗血清1:500-1 000稀釋均可有效地檢測新疆辣椒和加工番茄上CMV。

圖2 CMV CP表達產物的SDS-PAGE分析

3 討論

CMV是迄今已知病毒中寄主范圍最廣泛的病毒，具有高度變異性和強適應性，在寄主上產生花葉，矮化，厥葉，褪綠，過敏性壞死等癥狀，這些癥狀大多以混合性出現，在新疆CMV也常與其它病毒混合侵染［19］，產生多種不同的癥狀［20］。通常CMV亞組I引起較嚴重的壞死、失綠、矮化或蕨葉等癥狀，而CMV亞組II只引起較溫和的斑駁和花葉癥狀，并在接種葉上產生蝕紋斑［1，21-22］。已報道CMV亞組IA和CMV亞組II在全世界范圍內都有分布，而CMV亞組IB主要在亞洲地區，且CMV亞組IB的變異率高于CMV亞組IA和CMV亞組Ⅱ變異率［11］。

圖3 感染CMV的辣椒葉組織的Western blot特異性檢測

圖4 感染CMV的加工番茄葉組織的Western blot特異性檢測

新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等等不同寄主植物上的CMV均歸為CMV IB亞組，使用從美國NEOGEN生物技術有限公司購買的CMV I型抗體可以有效檢測番茄、南瓜等寄主上CMV，然而從新疆石河子蔬菜研究所蔬菜種子繁育基地上采集的辣椒樣品上其檢出率極低，在加工番茄上也存在漏檢的現象［15］。酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immol/Lunosorbent assay，ELISA）是目前應用非常廣泛的適用于大田大量樣品病毒病的快速檢測的免疫學方法，利用病毒外殼蛋白制備基因工程抗體，已廣泛應用于CMV抗血清的制備［16］。

CMV是新疆加工番茄、辣椒等經濟類蔬菜上危害最嚴重的病毒［23-25］，因此本文從美國NEOGEN公司CMV I型抗體血清學檢測為陰性的新疆石河子蔬菜研究所采集辣椒LJ-10克隆、分析了CMV全基因組序列，并以其CP基因制備了多克隆抗體，為新疆CMV檢測、預防及研究病毒與寄主互作奠定了基礎。

4 結論

序列分析及系統進化樹結果表明，新疆辣椒LJ-10 CMV分離物屬于CMV亞組IB；成功構建了LJ-10 CMV CP基因的原核表達載體，制備了相應的多克隆抗體，抗血清效價為1∶500-1 000，能夠有效的用于新疆辣椒和加工番茄的檢測。

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(責任編輯 朱琳峰）

Genome Sequencing of CMV Isolated from Pepper in Xinjiang and Polyclonal Antibody Preparation of CP Gene

ZHOU Dong LIU Zhen LIU Li XU Peng-cheng ZHENG Yin-ying
（College of Life Sciences，Key Laboratory of Agriculture Biotechnology of Shihezi University，Shihezi University，Shihezi 832003）

This work aims to clone gene fragment of Cucumber mosaic virus（CMV）from pepper LJ-10 in Xinjiang，to analyze the sequence，construct the prokaryotic expression vector of CMV CP gene，and to prepare CP’s polyclonal antibodies. The complete genome fragments of RNA1（3 357 nt），RNA2（3 042 nt），and RNA3（2 212 nt）were cloned by RT-PCR，and compared with different CMV isolates from CMV subgroup IA，subgroup IB and subgroup II in the GenBank by sequence analysis and phylogenetic tree analysis. The CP gene of CMV in LJ-10 was cloned into prokaryotic expression vector pET-22b and expressed in Escherichia coli BL21（DE3），and the expressed proteins were purified. Rabbit was immunized with the purified protein to prepare the antiserum with CMV-specificity，and detected by indirect ELISA test and Western blot. As results，the genomes of RNA1，RNA2，and RNA3 were successfully cloned，the sequence analysis and phylogenetic tree analysis showed that the isolates belonged to CMV subgroup IB. The prokaryotic expression vector pET-CMV-CP was successfully constructed and expressed as a 27 kD recombinant protein in E. coli BL21（DE3）by IPTG induction，and whose molecular weight was identical to the expected one. The indirect ELISA test and Western blotting showed that the antiserum’s titer was 1：500-1 000. In conclusion，the CMV isolate from LJ-10 belongs to CMV subgroup IB. The prokaryotic expression vector of CMV CP gene from LJ-10 is successfully constructed，and the corresponding polyclonal antibody is prepared.

Cucumber mosaic virus；sequence analysis；coat protein gene；prokaryotic expression；Western blot

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0206

2017-01-06

國家自然科學基金項目（31460466）

周東，男，碩士研究生，研究方向：植物分子遺傳學；E-mail：983692757@qq.com

鄭銀英，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：植物病毒學與植物分子遺傳學；E-mail：69825983@qq.com