水稻無蠟質葉片突變體wcl1的圖位克隆

王佳梅 安雪嬌 張治國

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

研究報告

水稻無蠟質葉片突變體wcl1的圖位克隆

王佳梅 安雪嬌 張治國

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

從水稻T-DNA插入突變體庫中篩選獲得1份葉片表皮無蠟質的突變體wcl1（Wax Crystal-Sparse Leaf 1），突變體wcl1有如下主要特征：一是突變體葉片角質層蠟質減少，二是突變體的干旱敏感性高于野生型。通過圖位克隆技術，克隆了wcl1基因，其編碼酮酯酰輔酶A（LOC_OS09g25850），在突變體中LOC_OS09g25850基因的第10個外顯子處鳥嘌呤（G）突變為胸腺嘧啶（T）導致轉錄提前終止，經分析表明突變體wcl1是一個wsl2基因的等位突變體。

水稻；無蠟質葉片突變體；圖位克隆

植物角質層蠟質是一層覆蓋在植物葉片表面的表皮細胞的脂肪性物質，它具有防止植物體內水分喪失［1-3］、對抗非生物脅迫干旱［4］、保護植物抵御紫外輻射以及幫助葉片免受積聚灰塵、花粉和空氣污染［5］的影響、抵抗細菌和真菌類病原菌［6-8］等作用。研究表明，有蠟質（白霜狀）表型的材料其抗旱節水性和產量都要高于無蠟質表型的材料［9，10］。雙子葉植物擬南芥是典型的葉片角質蠟質含量低的植物，葉片表面缺乏蠟質晶體，而單子葉模式植物水稻葉片角質蠟質含量豐富。水稻作為重要的模式作物，其蠟質調控基因的研究將有利于提高其抗逆能力。目前，在擬南芥中對表皮蠟質的合成基因的調控研究較多［11-15］，而對水稻蠟質合成途徑研究較少。迄今，在水稻中已克隆了13個蠟質相關基因，其中wda1是水稻中第一個被克隆的蠟質基因，wda1突變體花藥表面蠟質晶體減少，花粉小孢子發育受阻，花粉外壁發育缺陷，從而雄性不育。wsl1基因是第一個克隆到的、影響水稻葉片表面蠟質含量的基因，編碼水稻KCS基因家族一員。大多蠟質基因過表達能夠顯著提高植物的抗旱性，但是部分附帶著一些不利農藝性狀：如矮化、育性低等形態特點，限制了這些蠟質基因的進一步應用。

為進一步研究水稻葉片蠟質合成的作用機理，利用本實驗室前期建立的一個水稻大容量T-DNA插入突變體庫［17］，從突變體庫篩選獲得15份葉片不粘水的突變體。本研究對其中一份無蠟質突變體wcl1（Wax Crystal-Sparse Leaf 1）開展研究，從遺傳、表型特征上進行分析，并圖位克隆控制突變體wcl1的基因，進一步探索利用水稻無蠟基因提高水稻耐旱的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻無蠟質突變體wcl1來自本實驗室所創制的粳稻品種日本晴（Oryza sativa L. japonica cv. Nipponbare）T-DNA插入突變體庫。經過多次自交，突變體wcl1性狀穩定遺傳，后代無性狀分離。

1.2 方法

1.2.1 遺傳規律和表型性狀統計 將突變體wcl1種植農科院試驗基地，觀察表型。水稻成熟后統計其農藝性狀。同時將突變體wcl1和野生型進行正反交，統計F2代分離規律。

1.2.2 突變體wcl1和野生型水稻葉片的掃描電鏡觀察 在正常大田生長條件下，在抽穗期取野生型和突變體的劍葉，置于空氣中自然風干，將樣品置于JEOUFC-1600鍍膜機上噴金后，在掃描電子顯微鏡（JSM-6380LV）下觀察、拍照。

1.2.3 圖位群體的構建 將突變體wcl1與秈稻廣親和親本Dular進行正反交，收獲F1、F2種子，將F2種于大田，取隱性單株進行遺傳定位和基因克隆。定位群體、日本晴及Dular的葉片DNA提取參照改進的CTAB法［18］。初定位用3個混池，每個混池由3個隱性單株組成，同時提取500份隱性表型單株DNA用于精細定位。

1.2.4 圖位克隆

1.2.4.1 分子標記設計及PCR擴增 基于不同水稻品種產生的基因組插入與缺失差異，應用網上公布的粳稻日本晴與秈稻9311全基因組序列的比對結果，尋找具有差異的基因組片段來設計引物。引物設計所用軟件為DNAMAN VERSION 4.0，用于對日本晴和Dular的DNA 進行PCR擴增，來獲取多態性。累計設計了初定位引物共200對，實際檢測可用引物110對，12條染色體中平均3 Mbp設計一對引物。

PCR擴增體系（20 μL）：2×buffer 10 μL，20 pmol/L引物（正向+反向）2 μL，模板DNA（100 ng）2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1μL，rTaq DNA 聚合酶1 μL，ddH2O補足為10 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃總延伸5 min。根據PCR產物片段差異的大小選擇4%的瓊脂糖凝膠電泳（插入或缺失片段16 bp以上）或10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（插入或缺失片段5 bp以上）檢測，結果用凝膠成像儀記錄下來。

1.2.4.2 精細定位 應用圖位克隆［18］技術，利用初定位引物對3個DNA混池、日本晴及Dular進行PCR擴增和凝膠電泳，確定連鎖關系，得到共分離引物后，在區間內設計精細定位引物，擴大定位群體，逐漸縮小定位區間。

根據凝膠電泳結果，將與隱性親本帶型一致的標為1型帶，與顯性親本一致的標為2型帶，同時具有雙親本帶型的標為3型帶，統計各帶型數量和分布規律。

1.2.4.3 突變基因分析 對精細定位區段內的候選基因進行測序，尋找到突變基因，并對該基因和突變位點進行生物信息學相關分析，進一步闡明表型與基因的對應關系。

1.2.4.4 干旱脅迫分析 利用20%PEG4000的水培營養液模擬干旱脅迫環境，對生長至三葉期的野生型和wcl1突變體進行PEG4000干旱處理。每隔1 d對野生型和突變體進行表型觀察、拍照。并統計突變體wcl1和野生型葉片在干旱條件下（0-8 h）葉片水分散失率（注：在正常生長條件下，突變體與野生型水稻散失率沒有顯著區別）。

2 結果

2.1 突變體wcl1形態學特征和細胞學特征

與野生型日本晴相比，突變體wcl1的農藝性狀（株高、分蘗數、花期等）沒有顯著差別（圖1-A）。但是，在粘水后，兩者呈現顯著的差別，因野生型葉皮有蠟質，呈現出粘水特性，而突變體wcl1葉片因缺少蠟質，表現為不粘水（圖1-B）。掃描電鏡（SEM）觀察顯示，與野生型相比，突變體wcl1表皮葉片蠟質晶狀體密度降低、含量減少，乳突數量減少。這可能是突變體wcl1呈現不粘水的主要原因（圖1-C、D）。

圖1 突變型與野生型表型比較圖

2.2 突變體wcl1耐旱性試驗

由于葉片角質層與非氣孔水分散失的功能有關，突變體水稻的耐旱性很可能也會改變。為了驗證該假設，對萌發3葉期的野生型和突變體wcl1進行干旱處理。處理前兩者生長狀態基本一致（圖2-A），干旱處理3 d時，發現突變體wcl1已基本卷曲枯萎，而野生型有80%植株表現綠色（圖2-B），結果表明突變體wcl1是一個干旱敏感突變體（圖2-C）。

2.3 突變體wcl1遺傳分析

為了研究突變體wcl1的遺傳規律，我們進行了突變體wcl1與野生型的正交與反交，F1代葉片表面蠟質表型表現為野生型，表明該表型由隱性核基因控制。統計了F2代植株的分離比（突變體表型∶野生型表型）結果（表1）顯示差異顯著，符合孟德爾 1∶3的分離規律，表明突變體表型受一對單隱性核基因控制。

圖2 野生型和突變體wcl1干旱試驗比較圖

表1 F2代分離群體統計結果

2.4 突變體wcl1的初定位和精細定位

用均勻分布于全基因組的110對初定位引物對日本晴和Dular的3個混池、進行PCR擴增和凝膠電泳檢測，發現3個混池和9號染色體長臂上的Indel1-1和Indel1-2分子標記連鎖。再用Indel1-1和Indel1-2分子標記對17株F2代單株進行進一步連鎖分析，結果表明該分子標記確實與突變位點連鎖，將基因鎖在分子標記Indel1-1（圖3-A）和Indel1-2（圖3-B）之間。

2.5 突變體wcl1的精細定位和圖位克隆

利用F2代群體，將基因WCL1鎖定在分子標記Indel1-1和Idel1-2的區間內（圖4-A），在區間內再設計新的分子標記P1和P2，并進一步縮小了區間（圖4-B）。對該區間4個候選基因Os09g25830、Os09g25840、Os09g25850、Os09g25860（圖4-C）在突變體wcl1中進行PCR擴增并測序，發現在Os09g25850中的一個堿基鳥嘌呤（G）顛換為胸腺嘧啶（T）（圖4-D），經生物信息學分析，該突變導致轉錄提前終止。

圖3 突變體wcl1基因連鎖分析電泳圖

圖4 基因wcl1圖位克隆

3 討論

本研究通過篩選水稻T-DNA突變體庫，獲得了一個穩定遺傳的隱性無蠟質的突變體wcl1，相對于野生型，其具有葉片失水率快，不耐干旱等特點。對成熟期葉片進行掃描電鏡觀察，發現突變體wcl1葉片表面缺少蠟質，這可能是使植物葉片不粘水的主要原因。雖然突變體wcl1是從T-DNA插入突變體庫篩選獲得，但是其不是由T-DNA插入引起。我們通過圖位克隆該基因，其突變位點在LOC_ OS09g25850基因第10外顯子上，發生鳥嘌呤（G）顛換為胸腺嘧啶（T），造成基因轉錄提前終止，從而致使基因失活，且該基因等位于wsl2［19］。LOC_ OS09g25850編碼β-酮脂酰輔酶A合成酶（LOC_ OS09g25850），是超長鏈脂肪酸延伸過程中的關鍵酶，負責蠟質成分前體的合成。雖然它與wsl2基因等位，但是其屬于不同的突變方式，在wcl1中LOC_OS09g25850基因提前終止，而在wsl2中LOC_ OS09g25850基因的第六外顯子與內含子不能正確剪切，wcl1的突變位置位于第10外顯子處，相較wsl2，wcl1可能屬于一個弱突變。該研究結果明確了突變體wcl1的表型特征與遺傳基礎。

干旱等非生物逆境造成農作物的生長抑制和嚴重的減產［20，21］。植物從水生的藻類進化到陸生植物，處于最外層的表皮蠟質提供了必需的保護層以阻擋體內水分流失，使得植物能夠適應干旱等不利環境［22］。目前雖然已經發現了多個蠟質代謝相關基因參與了植物對干旱環境的適應，但是大部分均沒有用于改良農作物的抗旱性實踐。突變體wcl1對干旱敏感特性為進一步利用wcl1基因用于植物的耐旱性遺傳改良提供了新的啟示。

4 結論

本實驗篩選獲得1個無蠟質突變體wcl1。克隆了WCL1基因，雖然它與WSL2基因等位，但是其屬于不同的突變方式，wcl1是提前終止，而wsl2不能正確剪切。

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（責任編輯 李楠）

Mapping-based Cloning of a Wax Crystal-Sparse Leaf Mutant wcl1 in Rice

WANG Jia-mei AN Xue-jiao ZHANG Zhi-guo
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Here a wax crystal-sparse leaf mutant（wcl1）was screened from rice T-DNA Insertion Mutant Library. The mutant wcl1has two main features as following：1）the wcl1 leaf cuticular wax reduced；2）the drought sensitivity in the wcl1 plant was higher than wild type. Map-based cloning of wcl1 revealed that a point mutation of G to T in the 10th exonof gene LOC_OS09g25850encodingketoacyl coenzymeA resulted in the termination of transcription. The analysisshowed that the wcl1was allelic to wsl2.

rice；wax crystal-sparse leaf mutant；map-based cloning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0132

2017-02-27

中國農業科學院創新工程（CAAS-XTCX2016002）

王佳梅，女，碩士，研究方向：植物分子生物學及基因工程；E-mail：953867377@qq.com

張治國，男，副研究員，研究方向：植物基因功能組；E-mail：zhangzhiguo@caas.cn