DSCR4基因在母胎間的甲基化差異及其臨床價值

麻妙艷,乞艷華,周 琦,鄔晉芳,周 妮,閆桂花

(1西安交通大學第二附屬醫院超聲科,西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫院婦產科;*通訊作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)

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DSCR4基因在母胎間的甲基化差異及其臨床價值

麻妙艷1,乞艷華1,周 琦1,鄔晉芳2*,周 妮2,閆桂花2

(1西安交通大學第二附屬醫院超聲科,西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫院婦產科;*通訊作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)

目的 探討孕婦外周血中游離胎兒DSCR4基因的母胎甲基化差異,分析u-DSCR4基因的含量與孕周的相關性。 方法 共收集研究對象外周血樣本76例(包括健康未妊娠組10例,正常早、中、晚妊娠組各12例,唐篩高危組20例,正常產后10例),用甲基化特異性PCR方法擴增DSCR4基因,定性檢測在各組中的擴增情況,用實時熒光定量PCR擴增方法進行定量檢測,分析各組中的u-DSCR4基因的含量變化。 結果 未妊娠組均未檢出u-DSCR4基因;正常妊娠組u-DSCR4基因檢出率為72.2%。中期妊娠、晚期妊娠組其含量分別是早期妊娠的1.75倍、2.50倍。孕有不同性別胎兒的母體血漿中u-DSCR4基因含量無顯著性差異。唐氏血清學篩查高危組u-DSCR4基因檢出率為75%,其含量是正常中期妊娠組的2.95倍。超聲篩查異常組u-DSCR4基因檢出率為75%,其含量與正常早期妊娠組相比較無明顯差異。 結論 DSCR4基因是具有母胎表觀遺傳學差異的可靠胎兒特異性標志物,其含量隨孕周的增加而升高、與胎兒性別無關,在唐氏血清學高危組有增高趨勢。

DSCR4； 甲基化; 唐氏綜合征

人類常見染色體異常疾病中,21三體綜合征發病率較高,在活產兒染色體病中占70%[1],本文選取唐氏綜合征關鍵區域(Down’s syndrome critical region,DSCR)具有母胎甲基化差異的DSCR4基因為目的基因[2],在胎兒組織中呈低甲基化狀態(表示為u-DSCR4),而在相應的母體自身組織中呈高甲基化狀態(表示為m-DSCR4),探索21三體發生潛在風險預測的表觀遺傳學標記,進行有關孕婦外周血中u-DSCR4基因含量研究,希望能為唐氏綜合征的產前診斷提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2016-03～2016-09就診于本院的正常妊娠婦女36例,唐氏綜合征篩查高危孕婦20例,10例健康未妊娠女性志愿者,10例正常產后48 h健康婦女。所有研究對象均無內外科及腫瘤相關疾病,年齡<35歲,體質量<100 kg。入組標準:①妊娠組:首次、單胎妊娠,自然受孕,無妊娠并發癥;②健康未妊娠組:無孕產史;③產后組:首次妊娠,正常分娩。本研究已取得所有研究對象的知情同意及醫院倫理委員會認可。將各組平均年齡進行單因素方差分析,差異不顯著,各組間差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

表1 各組研究對象的年齡和孕周比較

Table 1 Comparison of age and gestational weeks among different subjects

分組n平均年齡(歲)平均孕周(周)未妊娠1026.67±1.67正常妊娠 早期1226.44±3.5311.15±0.36 中期1226.80±3.0516.20±1.74 晚期1225.90±4.0038.40±1.43唐篩高危組 血清學篩查1227.33±3.6316.50±1.52 超聲篩查826.33±2.0611.28±0.05產后48h健康1027.33±4.65

1.2 方法

1.2.1 超聲篩查 使用GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀,選用二維凸陣探頭,頻率為2-5 MHz,檢測孕早期11-13+6周孕婦胎兒頸項透明層(nutral translucency,NT)厚度,采用NT大于3 mm為篩查異常的陽性切斷值[3]。

1.2.2 血清篩查 采用孕中期二聯血清學篩查方法進行篩查,以AFP+β-HCG為母體篩查標記物,使用Au-toDELFIA自動時光分辨檢測系統,試劑盒來源于PerkinElmer公司,采用LifeCycle統計軟件處理分析,以大于1/270為陽性切斷值[4,5]。

1.2.3 DSCR4檢測方法 分別抽取各組研究對象肘靜脈血2 ml,用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取DNA,DNA經亞硫酸氫鹽處理,甲基化特異性PCR擴增,擴增體系及條件控制嚴格按照常規PCR要求進行,分別擴增u-DSCR4基因、m-DSCR4基因、β-actin基因(內參基因),引物按照參考文獻[6]設計,擴增產物電泳后觀察,判斷此兩種基因在各組中的擴增情況。

以亞硫酸氫鹽處理后的血漿DNA為模板,應用染料型SYBR Green I-實時熒光定量PCR定量[7,8]檢測各妊娠組目的基因u-DSCR4的含量,β-actin為內參基因,擴增體系及條件控制嚴格按照實時熒光定量PCR要求進行。結果判定使用Delta-delta Ct相對定量法。

1.3 統計學處理

計算公式如下:ΔCt=Ct目的基因u-DSCR4-Ct內參基因β-actin；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組；2-ΔΔCt=各組目的基因相對于對照組目的基因含量的倍數。

2 結果

2.1 定性結果

各組常規PCR產物電泳結果顯示在所有孕婦外周血中均存在u-DSCR4和m-DSCR4兩個基因條帶,即既包含非甲基化狀態,也包含高甲基化狀態;而在所有健康未孕及產后48 h健康婦女外周血中僅出現m-DSCR4一種基因條帶,即僅存高甲基化狀態。提示DSCR4基因在胎兒組織中呈低甲基化狀態,而在相應的母體自身組織中呈高甲基化狀態。亞硫酸氫鹽處理后健康未孕婦女、正常妊娠婦女、產后48 h健康婦女血漿u-DSCR4、m-DSCR4基因的擴增產物電泳結果見圖1。

1.健康未孕婦女u-DSCR4基因的擴增;2.健康未孕婦女m-DSCR4基因的擴增;3.正常妊娠婦女u-DSCR4基因的擴增;4.正常妊娠婦女m-DSCR4基因的擴增;5.產后48 h婦女u-DSCR4基因的擴增;6.產后48h婦女m-DSCR4基因的擴增;7.陰性對照圖1 各組甲基化特異性PCR產物電泳結果Figure 1 Electrophoresis results of amplification products by methylation specific PCR

2.2 定量結果

10例健康未妊娠女性志愿者及10例產后48 h健康婦女樣本中均未擴增出目的基因u-DSCR4,但內參基因β-actin均見擴增,即目的基因不存在于健康的未妊娠婦女及產后婦女體內。

36例正常妊娠孕婦外周血中有26例檢出u-DSCR4基因,檢出率為72.2%。孕中、晚期孕婦外周血中u-DSCR4基因檢出量與早期妊娠相比較其差異具有顯著性,中期妊娠u-DSCR4基因的含量是早期妊娠的1.75倍,晚期妊娠u-DSCR4含量是早期妊娠的2.50倍(見表2)。

表2 正常早、中、晚妊娠組u-DSCR4基因相對定量數據

Table 2 Comparison of relative quantification of u-DSCR4 gene among early,medium and late pregnancy groups

組別n陽性平均ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt早期妊娠1279.38±1.350.00±1.35-中期妊娠12108.57±1.19-0.81±1.191.75晚期妊娠1298.06±0.89-1.32±0.892.50

隨訪出生后胎兒性別,共計男性胎兒17例,女性胎兒14例,失訪5例,在未失訪31例患者中u-DSCR4基因檢出者共20例,其中男胎12例,女胎8例,假設其他因素相同的條件下將性別因素作為研究因素,發現孕有不同性別胎兒的母體血漿中u-DSCR4基因含量無顯著性差異(見表3)。

表3 正常妊娠孕男性胎兒、女性胎兒組u-DSCR4基因相對定量數據

Table 3 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in plasma of mothers with male or female fetuses

組別n陽性平均ΔCtP孕男胎組17128.61±0.38>0.05孕女胎組1488.59±0.50

12例唐氏綜合征篩查高危患者檢出u-DSCR4基因者9例,其u-DSCR4基因的含量是正常中期妊娠組含量的2.95倍(見表4)。

表4 正常中期妊娠組和血清學篩查高危組u-DSCR4基因相對定量數據

Table 4 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in medium-term pregnancy and serologic screening high-risk pregnancy

組別n陽性平均ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt中期妊娠12108.57±1.19-0.81±1.19—血清學高危1297.01±0.54-1.56±0.542.95

8例超聲檢查結果異常患者檢出u-DSCR4基因者6例,其u-DSCR4基因的含量與正常早期妊娠組含量相比較無明顯差異。

表5 正常早期妊娠組和超聲檢查異常組u-DSCR4基因相對定量數據

Table 5 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in early pregnancy and ultrasound abnormal pregnancy

組別n陽性平均ΔCtP早期妊娠1279.38±1.35>0.05超聲檢查異常868.50±0.42

3 討論

表觀遺傳改變是細胞內除基因組外的遺傳物質發生改變,基因型未變而表型卻發生變化,DNA甲基化修飾是表觀遺傳的重要形式之一。近年來隨著表觀遺傳學的不斷發展,2008年Chim等[9]系統研究了21號染色體上具有母胎甲基化差異的標志序列,據此可以將母體外周血中來源于21號染色體的游離DNA片段加以區別,即能將胎兒DNA從母體DNA背景中區別出來。本實驗中20例非妊娠狀態女性組均未擴增出u-DSCR4基因,僅擴增出m-DSCR4基因,而妊娠組擴增出兩條基因條帶,證實了u-DSCR4基因做為胎兒特異性的標志是可靠的,是胎兒特有的具有母胎表觀遺傳學差異的標志物,并且產后清除很快,不受前次妊娠的影響,在判斷本次妊娠中具有重要價值。

本實驗共收集正常妊娠孕婦標本36例,其中早、中、晚期妊娠各12例。目的基因相對定量顯示中期妊娠、晚期妊娠組u-DSCR4的含量分別是早期妊娠的1.75倍,2.5倍,表明正常孕婦血漿中u-DSCR4基因的檢出量隨妊娠進展表現出升高趨勢,隨著妊娠進展,游離胎兒DNA含量隨之增多。本實驗不能提供妊娠周數與游離胎兒DNA含量具有線性關系的證據,如若采用絕對定量法進行檢測,則可能解決這個問題。絕對定量法須獲得目的基因u-DSCR4標準品,以精確計算目的基因u-DSCR4的拷貝數,繪制出標準曲線。目前研究孕婦外周血中游離胎兒DNA含量與孕周的關系多采用橫斷面研究方法,即樣本來源于同一妊娠階段的不同孕婦,若能夠監測同一孕婦在不同妊娠階段外周血中游離胎兒DNA的含量,將能夠更有力地證明孕婦外周血中游離胎兒DNA含量與妊娠時期的關系。

DSCR4基因位于21號染色體上,故其含量可判斷胎兒21號染色體數目是否存在異常。本實驗中唐氏血清學篩查高危組目的基因u-DSCR4含量較正常中期妊娠組明顯升高,提示u-DSCR4基因有望成為胎兒特異性標志物進行21-三體的產前診斷,但在母體血漿中的含量與唐氏綜合征的相關性有待于大樣本隨訪染色體核型分析結果進行進一步證實。

研究發現NT增厚與胎兒染色體異常引起的頸后皮下液體積聚有關,對胎兒染色體異常等有較好的預測價值[10],但是也有研究表明即使胎兒染色體正常,也可能出現NT值的異常情況[11]。本研究中超聲異常組孕婦外周血漿中u-DSCR4基因與正常妊娠組相比較并未發現有顯著差異,提示超聲異常并非唐氏綜合征篩查的特異性指標,但因樣本量較小,有待于大樣本實驗進行證實。

綜上所述,本研究表明DSCR4基因是具有母胎表觀遺傳學差異的可靠胎兒特異性標志物,其含量隨孕周的增加而升高、與胎兒性別無關,在唐氏綜合征高危組有增高趨勢。近年來母體外周血中胎兒游離DNA的含量與妊娠相關疾病備受學者關注,但有關DSCR4基因研究的相關報道甚少,目前21號染色體上已發現具有母胎甲基化差異的基因包含AIRE,POTE及DSCR4基因,迄今為止沒有DSCR4基因含量研究的相關報道。孕婦外周血中u-DSCR4與唐氏綜合征的特征性表型尤其是智力低下有密切關聯[12],但是如何導致唐氏綜合征特征性表型的機理尚不明了,我們期待有關DSCR4基因的研究有突破性的進展。

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Methylation difference of DSCR4 gene between maternal and fetal and its clinical value

MA Miaoyan1,QI Yanhua1,ZHOU Qi1,WU Jinfang2*,ZHOU Ni2,YAN Guihua2

(1DepartmentofUltrasound,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wjf2yuan@126.com)

ObjectiveTo investigate the methylation difference of DSCR4 gene between maternal and fetal,and analyze the correlation of u-DSCR4 gene content with the gestational age.MethodsSeventy-six subjects were collected according to the standard,including 10 healthy non-pregnant women,12 normal pregnant women of early pregnancy,12 normal pregnant women of medium pregnancy,12 normal pregnant women of late pregnancy,20 patients with high risk Down’s syndrome,10 women at postpartum 48 h.Methylation specific PCR was used to amplify the u-DSCR4 and m-DSCR4 genes.Real-time quantitative PCR was used to analyze the content of the u-DSCR4 gene and its influencing factors in each group.Results①The u-DSCR4 gene was not detected in non-pregnant women.In normal pregnancy,the detection rate of the u-DSCR4 gene in plasma was 72.2%.The concentration of the u-DSCR4 gene in the medium-term and third-trimester pregnancy was respectively 1.75 times and 2.50 times of early pregnancy.The concentration of the u-DSCR4 gene was not affected by the sex of the fetus.The detection rate in paitents with high serology screening risk of Down’s syndrome was 75%,and the concentration was 2.95 times of the medium-term pregnancy.The concentrations of the u-DSCR4 gene in patients with ultrasound abnormalities had no significant difference from that of the first-trimester pregnancy.ConclusionThe u-DSCR4 gene is a reliable specific marker of fetal with epigenetic differences.Its concentration increases with the time of pregnancy and is also higher in patients with high serology screening risk of Down’s syndrome,and has nothing to do with fetal sex.So it can be used in prenatal genetic diagnosis.

DSCR4; methylation; Down’s syndrome

陜西省社會發展科技攻關基金資助項目(2015SF126,2016SF014)

麻妙艷,女,1986-03生,碩士,醫師,E-mail:miaoyanma@126.com

2016-12-29

R596.1

A

1007-6611(2017)04-0374-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.016