脂肪源性神經干細胞細胞移植對帕金森病大鼠腦內氧化應激損傷的影響

高 華,毛潔萍,羅 琴,楊新玲

(1新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830000;2烏魯木齊市友誼醫院神經內科;3新疆醫科大學附屬腫瘤醫院綜合內科;4新疆醫科大學第二附屬醫院;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

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脂肪源性神經干細胞細胞移植對帕金森病大鼠腦內氧化應激損傷的影響

高 華1,毛潔萍2,羅 琴3,楊新玲4*

(1新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830000;2烏魯木齊市友誼醫院神經內科;3新疆醫科大學附屬腫瘤醫院綜合內科;4新疆醫科大學第二附屬醫院;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

目的 探討脂肪源來源的神經干細胞細胞移植對帕金森病(Parkinson,s disease,PD)大鼠模型腦內氧化應激損傷的影響。 方法 獲取SD大鼠脂肪干細胞,利用神經營養因子將其誘導為神經干細胞。用6羥基多巴胺(6-OHDA)大鼠紋狀體內兩點毀損法制作PD模型(旋轉圈數>7 r/min),將成功大鼠模型隨機分為模型組和神經干細胞移植組,每組15只,另選15只正常大鼠為對照組。紋狀體區立體定位細胞移植后8周,進行模型組和細胞移植組大鼠旋轉圈數的行為學檢測。化學比色法分別檢測PD模型組、神經干細胞移植組、正常對照組大鼠腦內超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性以及丙二醛(MDA)含量。免疫組化法計數大鼠腦內酪氨酸羥化酶(TH)數量。 結果 細胞移植后8周,細胞移植組40 min內大鼠旋轉圈數(19±4)較PD模型組旋轉圈數(38±3)減少,大鼠腦內SOD、GSH、GSH-Px活性提高,MDA含量減少。TH計數表明,細胞移植組(22.40±3.89)、模型組(13.50±1.08)及正常對照組(43.20±3.32)三組比較差異有統計學意義(P<0.05)。 結論 脂肪來源的神經干細胞移植治療帕金森病模型大鼠可改善其行為活動,其機制可能與減輕大鼠腦內6-OHDA所致的氧化應激損傷有關。

脂肪干細胞； 神經干細胞； 氧化應激； 帕金森病； 細胞移植

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種以靜止性震顫、肌強直、運動減少及姿勢步態異常等為主要臨床表現的慢性退行性神經系統疾病。其病理特征主要為中腦黑質多巴胺神經元大量喪失及膠質細胞增生。既往研究認為氧化應激、線粒體功能障礙、泛素蛋白酶體系統(UPS)功能障礙、炎性反應、興奮性氨基酸毒性和凋亡等都參與 PD 的發病過程[1]。某些基礎及臨床研究表明,帕金森病患者的機體處于氧化應激狀態[2]。氧化應激作為帕金森病的發病機制之一,也被認為是致黑質DA 能神經元凋亡的可能因素之一[3]。干細胞以其多功能性,成為目前細胞移植治療神經系統疾病的熱點之一,如何選擇合適正確的干細胞來源也成為討論的重點。脂肪干細胞以易獲得性、多分化性的特點日益受到關注。

本實驗通過從SD大鼠脂肪中獲取脂肪干細胞(adipose stem cell),經過體外培養,采用神經生長因子進一步將其誘導成為神經干細胞,將其移植治療PD大鼠模型,觀察大鼠行為學及腦內氧化應激的各指標的變化,探討其保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯胺酮(福建古田藥業有限公司)；Ⅰ型膠原酶(Worthington美國)；胰酶(Sigma)；低糖DMEM、 DMEM/F12培養基、B27(Gibco美國)；胎牛血清(杭州四季青)；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),表皮生長因子(EGF) (Peprotech美國)；6羥基多巴胺(6-OHDA)，阿撲嗎啡(APO)(Sigma美國)；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒，谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒，丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。

1.2 實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠,(110±10)g,新疆醫科大學實驗動物中心提供,經過動物實驗醫學倫理審核,倫審編號:A-20141008019,實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。參照文獻[4]的大鼠腦立體定位圖譜,依據文獻[5]在右側黑質區和腹側被蓋區注射,采用兩點單側6-OHDA注射法制備 PD模型,造模1周后以腹腔注射APO(0.5 mg/kg),持續觀察40 min,以恒定向左側旋轉并平均轉速大于7 r/min視為成功PD模型。將造模成功大鼠隨機分為模型組和神經干細胞移植組,每組15只。另選15只正常大鼠為對照組。

1.3 脂肪干細胞的培養、神經干細胞的誘導及細胞的移植

依據既往實驗方法[6],腹腔注射氯胺酮(0.75 ml/100 g)麻醉SD大鼠,無菌取其腹股溝處脂肪,進行體外培養、純化脂肪干細胞,傳至第3代將其置于DMEM/F12+2% B27+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF的神經干細胞培養基中誘導分化為神經干細胞,以Nestin表達陽性為檢測標準。將誘導的神經干細胞在腦立體定位下給予大鼠右側紋狀體兩點移植:前囟后(0.2±0.1)mm,矢狀縫右側(2.5±0.1)mm,硬膜下(5.0±0.1)mm;前囟后(1.0±0.1)mm,矢狀縫右側(3.0±0.1)mm,硬膜下(5.5±0.1)mm。

1.4 細胞移植后各組大鼠的行為學檢測

細胞移植后8周,在APO誘導下,分別檢測脂肪源性神經干細胞移植組和單純模型組大鼠的旋轉圈數的變化。

1.5 檢測腦組織勻漿氧化應激指標

大鼠的行為學檢測結束后,將三組大鼠處死獲取其紋狀體區腦組織0.2 g低溫狀態下研磨并進行勻漿,將勻漿液以4 000 r/min,離心15 min,取其上清液用比色法測量MDA、SOD、GSH和GSH-Px。操作方法按照按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行測試。

1.6 免疫組化染色計數TH

大鼠安樂死后取腦,4%多聚甲醛固定,脫水、包埋,常規行石蠟切片,片厚6 μm,取紋狀體部分腦片行TH免疫組織化學染色。應用DAB試劑盒顯色。每組各取2只大鼠,每只取5張紋狀體區片,每張片取2個不同視野,計數TH陽性細胞數。

1.7 統計學分析

實驗數據按完全隨機對照設計的要求收集整理,所有數據以均數±標準差表示,全部數據采用SPSS17.0軟件進行處理,兩樣本均數比較先進行方差齊性檢驗,如方差齊采用獨立樣本t檢驗,方差不齊采用t′檢驗。多個樣本均數比較采用單因素方差分析,方差不齊采用近似F檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物行為學檢測

細胞移植后8周,經APO誘導后,脂肪源性神經干細胞移植組與模型組比較,大鼠旋轉圈數顯著減少[(19±4)r/minvs(38±3)r/min],差異有統計學意義(P<0.05),行為學得到有效改善。

2.2 各組大鼠紋狀體SOD、GSH、GSH-Px和MDA含量

細胞移植后8周,細胞移植組與正常組及模型組比較,腦內MDA含量有所下降,SOD、GSH和GSH-Px活性有所上升,但未能達到正常,三組間差異均有統計學意義(P<0.05,見表1)。

組別SOD(nU/ml)GSH(mg/g)GSH-Px(nU/g)MDA(nmol/mg)模型組99.17±4.235.22±0.441.96±0.147.27±0.30細胞移植組113.72±11.556.16±0.302.87±0.204.85±0.74正常對照組203.13±16.178.05±0.373.80±0.223.77±0.33 F345.34235.70348.84190.97 P0.000.000.000.00

2.3 各組大鼠黑質區TH計數

細胞移植后8周,脂肪源性神經干細胞移植組大鼠黑質區TH表達的數量較模型組有所增加,但少于正常對照組,三組間TH數量比較差異有統計學意義(P<0.05,見表2,圖1)。

組別TH計數FP模型組13.50±1.08254.470.00細胞移植組22.40±3.89正常對照組43.20±3.32

圖1 大鼠黑質區TH免疫組化染色 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining of TH in substantia nigra (×400)

3 討論

PD病理主要為黑質紋狀體DA能神經元缺失,目前研究表明氧化應激反應的增強也參與導致黑質細胞死亡過程[7,8]。正常情況下,黑質部位存在氧化和抗氧化之間的平衡,如SOD、GSH 的抗氧化保護系統發生異常,增強氧化應激反應,自由基生成過多,造成蛋白質及脂質過氧化損害,介導神經元的死亡[9，10]。許繼平等[11]在研究中發現帕金森病患者中抗氧化酶活性降低,過氧化脂質代謝增強。任金鵬等[12]在采用百草枯建帕金森病模型,小鼠腦內其超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、過氧化物酶活性降低及丙二醛水平升高。證實氧化應激、自由基損傷在帕金森病發生中起到不可小覷的作用[13,14]。

SOD是一種自由基的清除劑。GSH-Px可特異催化還原型谷胱甘肽GSH對過氧化氫的還原反應,起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。MDA可以反應機體內脂質過氧化的強度,間接反應細胞損傷程度。

細胞移植治療作為中樞神經系統疾病治療的一種可行性方式,具有廣泛前景,脂肪干細胞來源豐富,獲取簡單備受關注并且具有多種分化潛能[15，16]。本實驗采用獲取脂肪干細胞,在利用神經營養因子誘導成為神經干細胞移植治療帕金森模型鼠,這在前期實驗中已經實施并成功[17]。

本次實驗結果表明,PD模型組中SOD、GSH-Px、GSH的含量下降,MDA含量則升高明顯。提示帕金森病大鼠腦內的氧化反應被激活,多巴胺能神經元抗氧化應激損傷的水平下降,機體脂質過氧化反應增強,處于一種氧化應激狀態。這從一定程度上反映模型符合帕金森病氧化應激的發病機制,這也與陸明佳等[18，19]的研究結果一樣。在細胞移植后8周,脂肪源性神經干細胞移植的PD大鼠的旋轉行為有明顯改善,這也與既往研究結果一致[17]。細胞移植后8周脂肪源性神經干細胞移植組的MDA的含量較單純PD模型組的有所下降,但不能達到正常水平。而相應狀態下移植組大鼠腦內SOD、GSH-Px、GSH含量較模型組略有增加。大鼠黑質區TH計數結果說明,在經過細胞移植后可以提高TH數量,這也與其在APO誘導下旋轉圈數減少的行為學結果相一致,但不能促使其恢復正常功能狀態。提示脂肪源性的神經干細胞細胞移植治療后可以提高機體的抗氧化能力和清除自由基損傷的能力,從而可能在一定程度上保護了多巴胺能神經元[20，21],但其與帕金森病的其他發病機制,如線粒體功能異常、炎癥、細胞毒性間的相互關聯性仍然不清楚,需要進一步做有關相關通路的深入研究和探討。

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Effects of adipose-derived neural stem cell transplantation on oxidative stress reaction in rats with Parkinsons disease

GAO Hua1,MAO Jieping2,LUO Qin3,YANG Xinling4*

(1DepartmentofNeurology,FifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2DepartmentofNeurology,UrumqiFriendshipHospital;3DepartmentofGeneralMedicine,AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity;4SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:poplar862@sohu.com)

ObjectiveTo explore the effects of adipose-derived neural stem cell transplantation on oxidative stress reaction in rats with Parkinson’s disease (PD).MethodsThe adipose stem cells from SD rat fat tissues were isolated and induced to develop the neural stem cell with neurotrophic factors.Meanwhile,the PD model was established through brain stereotoxic injection of 6-OHDA(7 r/min).The PD model rats were randomly divided into two groups:model group(n=15) and neural stem cell transplantation group(n=15).Fifteen normal SD rats were chosen as normal group.The behavior(number of rotation) was observed in model group and cell transplantation group at 8 week.Moreover,the contents of superoxidedismutase(SOD) and glutathione(GSH),the activity of glutathione peroxidase(GSH·Px) and malondialdehyde(MDA) in rat brain nigrostriatum were detected by chemical colorimetry.The number of TH in striatum was detected by immunohistochemical staining.ResultsAt 8 week,the rotation in 40 min was lower in neural stem cell transplantation group than in model group (19±4vs38±3,P<0.05).The contents of SOD,GSH,GSH-PX were increased compared with PD model group and normal group,while the content of MDA was decreased significantly.The quantity of TH were 22.40±3.89 in cell transplantation group,13.50±1.08 in model group,and 43.20±3.32 in normal group,and the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe adipose-derived neural stem cell transplantation can improve the behavior of PD rats,which may be related to the decrease of the injury of oxidative stress.

adipose stem cell; neural stem cell; oxidative stress; Parkinson’s disease; cell transplantation

新疆維吾爾自治區科技支疆基金資助項目(201501160)

高華,女,1979-08生,在讀博士,主治醫師,E-mail:gaohuasnow@163.com

2016-12-19

R742

A

1007-6611(2017)04-0333-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.007