奎尼丁對HEK293細胞hERG電流和hERG蛋白的影響

霍建華,郭雪艷,強 華,劉 平,白 玲,馬愛群

(1西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科,西安 710061;2陜西省人民醫院消化科;*通訊作者,E-mail:huojianhua2005@126.com)

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奎尼丁對HEK293細胞hERG電流和hERG蛋白的影響

霍建華1*,郭雪艷2,強 華1,劉 平1,白 玲1,馬愛群1

(1西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科,西安 710061;2陜西省人民醫院消化科;*通訊作者,E-mail:huojianhua2005@126.com)

目的 觀察奎尼丁對hERG電流和hERG通道蛋白表達的影響,進一步明確其導致長QT間期綜合征的機制。 方法 用脂質體轉染法將含有hERG基因的質粒轉入HEK293細胞,全細胞膜片鉗技術記錄電流和Western blot技術觀察hERG通道蛋白表達的影響。實驗分組:①HEK293細胞轉染進質粒48 h時加入不同濃度(0，1，3，10 μmol/L)的奎尼丁,并進行膜片鉗實驗觀察奎尼丁的瞬時作用。②HEK293細胞轉染進質粒24 h時往培養基加入不同濃度(1，3，10 μmol/L)的奎尼丁,繼續培養24 h洗脫奎尼丁后立即進行膜片鉗及Western blot實驗觀察奎尼丁的慢性作用。 結果 ①1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L組的最大尾電流分別為(55.9±3.8)pA/pF、(35.7±3.2)pA/pF及(15.5±1.4)pA/pF,均明顯小于對照(0 μmol/L)組(均P<0.05)。②不同濃度的奎尼丁孵育HEK293細胞后hERG電流無明顯變化。Western blot觀察到不同濃度奎尼丁作用下hERG蛋白表達無明顯變化。 結論 奎尼丁對hERG電流有瞬時直接抑制作用,但并非影響hERG通道蛋白的表達來改變hERG電流。奎尼丁對hERG通道的直接抑制作用可能為其引起長QT間期綜合征的根本機制。

長QT間期綜合征； 奎尼丁； hERG； HEK293

人ether-a-go-go相關基因(human-ether-a-go-go-related gene,hERG)定位于染色體7q35-36,在心肌組織中高度表達,編碼心肌細胞電壓門控鉀通道的α亞單位,α亞單位與MiRP1基因編碼的β亞單位結合后產生快速激活延遲整流鉀電流(rapidly activating component of delayed rectifier potassium current,IKr)[1,2]。多種藥物(常規抗心律失常藥物、抗生素、抗組胺藥物以及抗精神病藥物等)可阻斷hERG通道引起藥物性長QT綜合征,心電圖上表現為QT間期延長,T波異常,常引起尖端扭轉型室性心動過速,臨床上表現為反復發作性暈厥,甚至猝死。其主要機制是藥物對hERG 鉀通道產生直接抑制作用[3]。近年來發現,某些藥物對hERG鉀通道蛋白的轉運有抑制作用,導致細胞膜hERG通道表達降低,從而發揮阻滯效應,引起長QT綜合征[4]。奎尼丁是一種非選擇性鈉離子通道阻滯劑,為Ⅰa類抗心律失常藥,由于其致心律失常作用嚴重影響了其在臨床的引用。已有研究顯示奎尼丁對hERG通道電流的直接抑制作用為其致心律失常作用的主要機制[5]。但其奎尼丁是否對hERG鉀通道蛋白的表達轉運有影響還未見報道。本研究利用分子生物學及膜片鉗技術觀察其對hERG鉀通道的影響。

1 材料與方法

1.1 質粒及細胞株

質粒pcDNA3-WT-hERG、GFP-pRK5及HEK293細胞株由西安交通大學環境與疾病相關基因實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

脂質體2000TM試劑盒購自美國Invitrogen公司。抗hERG抗體購自以色列Alomone公司。辣根過氧物酶標記的羊抗兔IgG抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。奎尼丁購自美國Sigma-Aldrich公司。Axon-700B膜片鉗系統、DigiData-1322A數模轉換裝置及pCLAMP9.2膜片鉗數據處理軟件均為美國Axon公司產品。Syngene Chemi-Genius成像系統購自英國SynGene公司。

1.3 HEK293細胞的培養、轉染及處理

HEK293細胞培養在含有10%胎牛血清的高糖DMEM中。按照脂質體2000TM試劑說明進行操作,將pcDNA3-WT-hERG及GFP-pRK5(綠色熒光蛋白表達質粒,可作為pcDNA3-WT-hERG成功轉染進細胞的指示劑)共轉染進HEK293細胞。轉染質粒48 h后立刻進行實驗。實驗分組:①觀察奎尼丁的瞬時作用:HEK293細胞轉染進質粒48 h時加入不同濃度(1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L)的奎尼丁進行膜片鉗實驗;②觀察奎尼丁的慢性作用:HEK293細胞轉染進質粒24 h時往培養基加入不同濃度(1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L)的奎尼丁,繼續培養24 h洗脫奎尼丁后立即進行膜片鉗及Western blot實驗。

1.4 Western blot檢測hERG蛋白表達

HEK293細胞培養在100 mm培養皿中,將真核表達載體pcDNA3-WT-hERG轉染入細胞后第48小時時用PBS液洗滌兩次,NP-40裂解液(20 mmol//L Tris-HCl at pH 8,137 mmol/L NaCl,10% glycerol,1% nonidet P-40 and 2 mmol/L EDTA)和蛋白酶抑制劑進行細胞裂解。Bradford 法測量細胞總蛋白濃度。蛋白樣品用8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,一抗兔抗人HERG單克隆抗體4 ℃孵育12 h,二抗辣根過氧物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h,ECL發光液反應后利用Syngene Chemi-Genius成像系統照相。

1.5 全細胞膜片鉗技術記錄hERG電流

HEK293細胞轉染進pcDNA3-WT-hERG及GFP-pRK5后48 h收獲。實驗前將HEK293細胞制備成單細胞懸液并置于浴槽中使其貼壁良好;全細胞電流利用Axon-700B單探頭膜片鉗放大器、DigiData-1322A數模轉換裝置及pCLAMP9.2膜片鉗數據處理軟件進行記錄處理。細胞外液:137 mmol/L NaCl,4 mmol/L KCl,1.8 mmol/L CaCl2,1 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Glucose,10 mmol/L HEPES(pH 7.4)。電極內液:130 mmol/L KCl,1 mmol/L MgCl2,5 mmol/L EGTA,5 mmol/L MgATP,10 mmol/L HEPES(用KOH 調節pH值在7.2)。實驗在室溫(22-24 ℃)下進行。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 奎尼丁對hERG電流的瞬時作用

HEK293細胞轉染進質粒后48 h時加入不同濃度的奎尼丁后記錄hERG電流。細胞的鉗制電壓是-80 mV,命令電壓是-60 mV到+60 mV,階躍是10 mV,每一個命令電壓維持時間是2 s,緊接著細胞被鉗制在-40 mV并持續5 s以獲得尾電流[6]。從圖1A中可以看出,不同濃度的奎尼丁作用下hERG電流的形態相一致。圖1B顯示的是激活電流的I-V曲線,可以看出各組細胞的最大激活電流的命令電壓都是0 mV,且隨著濃度的增加,奎尼丁對hERG電流有抑制作用越明顯。圖1C顯示的是尾電流的I-V曲線,1 μmol/L、3 μmol/L及10 μmol/L組的最大尾電流分別為(55.9±3.8)pA/pF、(35.7±3.2)pA/pF及(15.5±1.4)pA/pF,均明顯低于對照(0 μmol/L)組(P<0.05,各組n=9)。以上結果說明奎尼丁對hERG電流有明顯的抑制。

圖1 給予不同濃度奎尼丁hERG電流的激活電流和尾電流I-V曲線Figure 1 I-V relationships for amplitudes of activation currents and tail currents recorded during test pulses under different concentrations of quinidine

2.2 奎尼丁對hERG電流的慢性作用

HEK293細胞轉染進質粒24 h后往培養基加入不同濃度的奎尼丁,繼續培養24 h后立即洗脫奎尼丁后記錄hERG電流。從圖2A顯示的是不同濃度的奎尼丁孵育HEK293細胞后記錄的hERG電流圖形。圖2B顯示的是激活電流的I-V曲線,可以看出各組細胞的最大激活電流的命令電壓都是0 mV,但各組在不同命令電壓下的激活電流密度無明顯變化(P>0.05)。圖2C顯示的是尾電流的I-V曲線,各組在不同命令電壓下的尾電流密度無明顯變化(P>0.05)。

2.3 奎尼丁對hERG蛋白表達的影響

HEK293細胞轉染進質粒后24 h時往培養基加入不同濃度的奎尼丁,繼續培養24 h立即洗脫奎尼丁后進行Western blot檢測hERG蛋白。運用Western blot技術發現hERG通道蛋白表現為兩條帶,135 kD為不完全糖基化的通道蛋白,滯留在胞質中;而155 kD為完全糖基化的通道蛋白,為轉運到胞膜上的hERG通道蛋白。圖3顯示的是不同濃度奎尼丁孵育轉染hERG質粒的細胞后檢測到的hERG蛋白表達,從圖中可看出,不同濃度奎尼丁下hERG蛋白表達無明顯變化,說明奎尼丁對hERG蛋白的表達無明顯影響。

3 討論

奎尼丁是一種非選擇性鈉離子通道阻滯劑,為Ⅰa類抗心律失常藥,由于其致心律失常作用已嚴重影響其在臨床上的應用。本實驗利用全細胞膜片鉗及Western blot技術觀察到:奎尼丁對hERG電流有明顯的瞬時抑制作用,并表現為濃度依賴性;慢性作用下,奎尼丁對hERG電流及hERG通道蛋白無明顯影響。

目前已經發現多種藥物(常規抗心律失常藥物、抗生素、抗組胺藥物以及抗精神病藥物等)可阻斷hERG通道引起藥物性長QT綜合征,其主要機制之一是藥物對hERG鉀通道產生直接抑制作用[7,8]。奎尼丁是較早發現的引起QT間期延長的藥物,可使2%-6%病人引起暈厥。奎尼丁不僅是鈉通道阻斷劑,研究發現其主要通過阻斷快速激活延遲整流鉀通道的α亞單位(hERG通道)引起QT間期延長,從而引起尖端扭轉性室性心律失常等臨床癥狀。本實驗通過膜片鉗亦證明了奎尼丁對hERG電流有明顯的直接抑制作用,并呈現濃度依賴性。

圖2 奎尼丁孵育24 h后hERG電流的激活電流和尾電流I-V曲線Figure 2 I-V relationships for amplitudes of activation currents and tail currents recorded during test pulses after cultured with quinidine for 24 h

圖3 不同濃度奎尼丁孵育后hERG通道蛋白的表達Figure 3 Western blot analysis of hERG protein after treated with quinidine

hERG通道蛋白在內質網中初步合成和組裝折疊后,在內質網中進行不完全糖基化。然后不完全糖基化的HERG蛋白被轉運到高爾基體內進行完全糖基化。最終完全糖基化和正確折疊的HERG通道蛋白被轉運到細胞膜上。運用Western blot技術發現hERG通道蛋白表現為兩條帶,135 kD為不完全糖基化的通道蛋白,而155 kD為完全糖基化的通道蛋白。近期研究顯示藥物性長QT綜合征的機制不僅是藥物對hERG通道有直接抑制作用,某些藥物還對hERG通道蛋白的表達與轉運有抑制作用[9,10]。三氧化二砷對hERG電流無直接抑制作用,而阻礙了hERG蛋白的轉運表達,當三氧化二砷作為治療血液系統疾病時,長期使用亦可引起長QT綜合征。西沙比利及普羅布考不僅直接抑制hERG電流,還影響hERG蛋白的表達轉運[11,12]。本實驗用不同濃度的奎尼丁孵育表達hERG蛋白的HEK293細胞后,運用Western blot技術檢測到hERG通道蛋白無明顯變化。說明奎尼丁不影響hERG通道蛋白的表達轉運。

綜上所述,奎尼丁對hERG鉀電流有直接抑制作用,但并不影響hERG通道蛋白的表達轉運。其對hERG通道的直接阻斷作用為奎尼丁引起長QT間期綜合征的根本機制。

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Effects of quinidine on hERG potassium current and hERG channel protein in HEK293 cell line

HUO Jianhua1*,GUO Xueyan2,QIANG Hua1,LIU Ping1,BAI Ling1,MA Aiqun1

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofGastroenterology,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;*Correspondingauthor,E-mail:huojianhua2005@126.com)

ObjectiveTo explore the effect of quinidine on ether-a-go-go related gene(hERG)current and hERG channel protein and its possible mechanism of quinidine-induced long QT syndrome.MethodsHEK293 cells were transiently transfected with plasmid containing hERG gene via Lipofectamine.The hERG current was observed by whole-cell patch-clamping and the expression of hERG channel protein was detected by Western blot analysis.①HEK293 cells were transfected with plasmid,and after 48 h the cells were treated with different concentrations(0,1,3,10 μmol/L)of quinidine and patch clamp experiments were operated for instantaneous effect of quinidine.②HEK293 cells were transfected into plasmid for 24 h,then treated with different concentrations of quinidine(1,3,10 μmol/L)for 24 h,and then the patch clamp and Western blot were operated to observe the chronic effect of quinidine.ResultsAfter HEK293 cells were transfected into the plasmid for 48 h,the hERG current was significantly inhibited after treated with different concentrations of quinidine.The maximal density of tail currents were(55.9±3.8)pA/pF,(35.7±3.2)pA/pF and(15.5±1.4)pA/pF in 1 μmol/L,3 μmol/L and 10 μmol/L quinidine groups,respectively(P<0.05vs0 μmol/L).HEK293 cells were transfected into plasmid for 24 h and cultured with different concentrations of quinidine for 24 h,the hERG current showed no significant change.Western blot result showed that there was no significant change in the expression of hERG protein in HEK293 cells cultured with different concentrations of quinidine.ConclusionQuinidine shows an immediate and direct inhibitory effect on hERG potassium current,but it does not affect the expression of hERG channel protein.The direct inhibition of hERG channel is the basic mechanism of long QT syndrome caused by quinidine.

long QT syndrome； quinidine； hERG； HEK293

國家自然科學基金資助項目(30801133)；陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2014JM2-8154)

霍建華,男,1979-03生,博士,主治醫生,E-mail:huojianhua2005@126.com

2017-01-04

R541.7

A

1007-6611(2017)04-0301-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.001