長春西汀注射液減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷*

葉永順， 劉 華

(廣東藥科大學附屬第一醫院內二科， 廣東 廣州 510080)

長春西汀注射液減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷*

葉永順， 劉 華△

(廣東藥科大學附屬第一醫院內二科， 廣東 廣州 510080)

目的： 觀察長春西汀注射液對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導大鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的作用，并研究初步的作用機制。方法：雄性Wistar大鼠50只，隨機分為正常對照組(control)、模型組(ALI組)以及長春西汀低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。正常對照組股靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(5 mL/kg)；模型組股靜脈注射LPS 10 mg/kg；長春西汀低、中和高劑量組股靜脈注射LPS 10 mg/kg，30 min后分別腹腔注射長春西汀注射液0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和1.2 mg/kg。伊紅染色觀察肺部組織病理學切片，TUNEL法檢測肺組織的細胞凋亡，分光光度法檢測并計算肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性，Western blot法檢測肺組織中NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、Bax與Bcl-2的蛋白水平。結果：與模型組相比，采用長春西汀給藥后，明顯減輕急性肺損傷的肺組織結構損傷與炎性細胞浸潤，降低肺組織凋亡的細胞數與MPO活性，下調細胞中NF-κB、ICAM-1、VCAM-1與Bax的蛋白表達水平，上調Bcl-2的蛋白表達水平。結論：長春西汀注射液對急性肺損傷大鼠的肺組織具有保護作用，可能與降低肺組織中MPO活性，以及調控NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、Bax與Bcl-2蛋白表達水平有關。

長春西汀注射液； 脂多糖; 急性肺損傷

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的早期階段，是由直接或間接原因導致的肺泡上皮細胞和內皮細胞的損傷[1]。臨床上主要表現為嚴重呼吸窘迫和低氧血癥，死亡率高達30%～40%[2]。目前主要的治療策略包括遏制全身炎癥反應，呼吸支持治療與糖皮質激素等，但未能有效地降低死亡率。因此，需要進一步研究能有效降低急性肺損傷死亡率的治療方法與有效藥物。

長春西汀(vinpocetine，Vin)，也稱為阿樸長春胺酸乙酯，由Gedeon Richter研發，目前主要的臨床應用是治療缺血性中風和其它由腦血管病變引起的疾病[3]。國外學者研究發現，長春西汀具有抗炎作用，能抑制血管平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬細胞和上皮細胞中腫瘤壞死因子α誘導的核因子κB(nuclear factor-κB， NF-κB)活化，進一步抑制炎癥因子的活化等[4]。由此，我們通過用注射脂多糖建立急性肺損傷大鼠模型，觀察長春西汀注射液對急性肺損傷大鼠的肺組織保護作用，并探討其初步機制。

材 料 和 方 法

健康雄性Wistar大鼠50只，SPF級，體重180～220 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號為SCXK 粵2014-0012，進行適應性飼養1周，術前12 h禁食，不禁水。

長春西汀注射液購自河南潤弘制藥股份有限公司；TUNEL試劑盒購自Sigma-Aldrich；抗NF-κB、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)與血管細胞黏附分子1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)抗體購自Santa Cruz；抗Bax與Bcl-2抗體購自碧云天技術公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物的分組與建模 將大鼠隨機分為5組(每組10只)：正常對照(control)組、模型組(ALI組)以及長春西汀低劑量組(Vin-L組)、中劑量組(Vin-M組)和高劑量組(Vin-H組)。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，正常對照組股靜脈注射0.9%氯化鈉注射液(5 mL/kg)；模型組股靜脈注射LPS 10 mg/kg；長春西汀低、中和高劑量組股靜脈注射LPS 10 mg/kg，30 min后分別腹腔注射長春西汀注射液0.2 mg/kg、0.7 mg/kg和1.2 mg/kg。若實驗大鼠出現呼吸頻率加快，皮膚發紺，提示脂多糖誘導的急性肺損傷模型建立成功[5]。

2.2 標本采集 給藥6 h后，經頸部正中切開皮膚，暴露右頸總動脈，頸動脈放血處死，開胸，取出左肺立刻置于液氮中低溫保存，取出右肺中葉用10%多聚甲醛固定，備用。

2.3 病理學檢查 將右肺中葉固定后，用石蠟包埋后切片，厚度約4 μm，分別加入二甲苯I、II，再依次浸入梯度乙醇，蒸餾水浸洗5 min×2次，甩干水分，用蘇木精染色15 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化，蒸餾水沖洗，1%伊紅溶液染色3 min，梯度乙醇浸洗，二甲苯I、II液各5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 將右肺中葉依次放入二甲苯I、II液各15 min，依次放入梯度乙醇各5 min，水化，PBS浸泡3 min，加入蛋白酶K處理30 min，洗滌，浸泡于3%雙氧水甲醇溶液，PBS洗滌，滴加TUNEL染色液1與2混合液反應30 min，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的檢測 凍存的肺組織100 mg，加入4 mL磷酸鉀緩沖液，冰浴中勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，沉淀加入4 mL含0.5% HTAB的磷酸鉀緩沖液，重懸，超聲，60 ℃水浴1 h，4 ℃、18 000 r/min離心10 min，取0.1 mL上清液，加入含鹽酸鄰聯茴香胺與過氧化氫的磷酸鉀緩沖液2.9 mL，25 ℃、460 nm波長下分光光度計測吸光度變化值，計算MPO活性。

采用馬鈴薯培養基[19]，分別接種10-5、 10-6、10-7、10-8四個稀釋梯度的懸浮液，將接種好的培養皿于25 ℃培養72 h后進行霉菌計數。計數時選取培養基上菌絲細長，菌落疏松呈絨毛狀面絮狀的菌落進行計數。

2.6 Western blot法檢測蛋白的表達 取凍存的肺組織，用干凈剪刀剪碎，玻璃勻漿器冰上勻漿，加入裂解液裂解30 min，將裂解液移至離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液進行蛋白定量，進行SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后，轉移至硝酸纖維素膜，加入封閉液中室溫孵育1 h，加入 I 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌2次，加入相應 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，化學發光法顯色，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶。

3 統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 15.0統計軟件進行分析，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數間的多重比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織病理學檢查

正常對照組大鼠的肺組織結構完整，肺泡間隔無水腫，無炎性細胞浸潤；模型組和長春西汀低、中、高劑量組大鼠的肺組織均出現明顯的損傷；模型組大鼠的肺組織損傷明顯，出現大量炎性細胞浸潤，肺泡結構不完整；采用長春西汀給藥后，肺泡結構略顯完整，并隨藥物濃度升高，炎性細胞浸潤逐漸減少，見圖1。

Figure 1.The effect of vinpocetine on the pathological changes of the lung tissues from the rats with ALI (HE staining， ×200).

圖1 長春西汀對急性肺損傷肺組織的病理學影響

2 肺組織中細胞的凋亡檢測

與正常對照組相比，在脂多糖的刺激下，模型組大鼠肺組織可見明顯的凋亡細胞；與模型組相比，長春西汀給藥組的肺組織凋亡細胞數隨藥物濃度升高而逐漸下降，見圖2。

Figure 2.The effect of vinpocetine on the cell apoptosis in the lung tissues (TUNEL staining， ×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖2 長春西汀對肺組織細胞凋亡的影響

3 肺組織中MPO活性的檢測

與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織中MPO活性明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，長春西汀低、中與高劑量組的肺組織中MPO活性明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effect of vinpocetine on the MPO activity in the lung tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖3 長春西汀對肺組織中MPO活性的影響

4 肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的變化

與正常對照組相比，模型組的NF-κB、ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達顯著上升(P<0.05)，與模型組相比，采用長春西汀給藥后，肺組織中NF-κB、ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達明顯下降，隨藥物濃度上升而下降幅度增大，見圖4。

Figure 4.The effect of vinpocetine on the protein expression of NF-κB, ICAM-1 and VCAM-1 in the lung tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖4 長春西汀對肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的影響

5 Bax與Bcl-2蛋白表達的變化

與正常對照組相比，模型組的Bcl-2蛋白表達顯著下降，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，采用長春西汀給藥后，Bcl-2的蛋白表達明顯升高，Bax的表達明顯下降(P<0.05)，高劑量組的變化幅度最大(P<0.05),見圖5。

Figure 5.The effect of vinpocetine on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the lung tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsALI group.

圖5 長春西汀對肺組織中Bax與Bcl-2蛋白表達的影響

討 論

肺組織炎癥和肺水腫是急性肺損傷的主要病理特征，病理學主要顯示為肺泡結構破壞，肺泡腔中出現大量炎性細胞浸潤，本實驗結果提示長春西汀能夠改善急性肺損傷的肺泡結構損傷，并降低炎性細胞的浸潤。中性粒細胞被激活后，釋放活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、花生四烯酸代謝產物等有毒物質，使肺毛細血管內皮和肺泡上皮實質細胞損傷[6-7]，研究表明降低中性粒細胞含量后，能夠改善急性肺損傷的肺損傷程度[8-9]。MPO是中性粒細胞溶酶體的特征酶，測定MPO的活性可以間接反映中性粒細胞在組織中的聚集程度，本實驗結果顯示急性肺損傷大鼠肺組織中MPO活性較高，而采用長春西汀給藥的大鼠肺組織中MPO活性顯著下降，提示長春西汀能夠降低中性粒細胞在肺組織的聚集。

NF-κB是廣泛存在于細胞的一種轉錄因子，在炎癥反應和細胞凋亡中發揮非常重要的作用。當細胞受到刺激時，如細菌脂多糖等，NF-κB進入細胞核內，與下游的細胞因子和炎癥介質基因的識別位點結合，進一步調控細胞因子和炎癥介質基因的表達[10]。黏附分子存在于細胞表面，作為介導細胞與細胞間、細胞與基質相互結合的細胞表面受體，主要參與細胞的識別、活化和信號轉導，在免疫應答和炎癥發生等方面具有重要作用[11]。VCAM-1通過調控單核細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞黏附至血管內皮表面，從而促使白細胞向炎癥部位聚集，導致血管內皮細胞受損。ICAM-1介導細胞間的黏附，促使相關抗原陽性白細胞黏附于ICAM-1陽性內皮細胞表面，進一步到達炎癥組織，促進炎癥細胞的遷移和趨化[12]。本實驗結果顯示，采用長春西汀給藥能夠降低脂多糖引起的急性肺損傷肺組織中NF-κB、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達水平，提示長春西汀抑制NF-κB蛋白的表達，進而抑制黏附因子ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達，可能與急性肺損傷的肺組織炎癥反應和細胞凋亡有關。

抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax作為細胞內源性線粒體通路的重要調節因子，二者的蛋白表達比例對線粒體的完整性具有非常重要的作用。當Bcl-2蛋白表達下降而Bax蛋白表達上升，會促使線粒體中的凋亡因子釋放至細胞質基質中，引起細胞凋亡[13]。本實驗結果顯示，急性肺損傷大鼠肺組織中凋亡細胞數顯著高于正常對照組，采用長春西汀給藥后明顯降低凋亡細胞數，Bax蛋白表達下降，Bcl-2蛋白表達上升。提示長春西汀通過調節Bax與Bcl-2蛋白表達與急性肺損傷肺組織細胞凋亡有關。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Vinpocetine injection attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats

YE Yong-shun, LIU Hua

(TheSecondDepartmentofMedicine,FirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:Liuhuagy63@163.com)

AIM: To observe the inhibitory effects of vinpocetine injection on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) in the rats and to explore the underlying mechanisms. METHODS: Male Wistar rats (n=50) were randomly divided into 5 groups: control group, ALI model group, and low, medium and high doses of vinpocetine treatment groups. The rats in control group were injected with 0.9% NaCl at 5 mL/kg through femoral vein. The rats in ALI model group

LPS at 10 mg/kg through femoral vein. After injected with LPS, the rats in vinpocetine treatment groups received vinpocetine at 0.2 mg/kg, 0.7 mg/kg or 1.2 mg/kg via intraperitoneal injection. The pathological changes of the lung tissues were observed under microscope with HE staining. The cell apoptosis in the lung tissues was detected by TUNEL staining. Myeloperoxidase (MPO) activity was measured by the method of spectrophotometry. The protein expression of NF-κB, ICAM-1, VCAM-1, Bax and Bcl-2 was determined by Western blot. RESULTS: Compared with ALI group, administration of vinpocetine significantly attenuated the structural injury of the lung and the infiltration of inflammatory cells. Moreover, vinpocetine decreased cell apoptosis and MPO activity in the lung tissues of ALI rats. In addition, the protein expression of NF-κB, ICAM-1, VCAM-1 and Bax was inhibited after vinpocetin treatment, whereas Bcl-2 expression was increased. CONCLUSION: Vinpocetine attenuates LPS-lung injury by reducing MPO activity and regulating NF-κB, ICAM-1, VCAM-1, Bax and Bcl-2 protein expression.

Vinpocetine injection; Lipopolysaccharide; Acute lung injury

1000- 4718(2017)07- 1278- 05

2016- 11- 08

2017- 02- 16

廣東省財政技術研究開發與推廣應用項目(No. 2060403)

R965； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.020

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△通訊作者 Tel: 020-61321847; E-mail： Liuhuagy63@163.com